Per iniziare, eseguire l'imaging time-lapse di linfociti T vivi isolati da tessuti linfoidi secondari murini. Per l'analisi della migrazione delle cellule T, aprire il software Velocity e creare una nuova sequenza di immagini. Seleziona e sposta i filmati al microscopio video con intervallo di tempo nell'area blu in Velocity.
Utilizzando lo strumento di miglioramento del contrasto, modificare la luminosità e il contrasto, quindi regolare le dimensioni dell'immagine a 0,325 micrometri per 20x e 0,65 micrometri per un ingrandimento 10x. Dopo aver configurato la sequenza per impostare i punti temporali, vai alla scheda di misurazione e deseleziona tutti i punti temporali. Quindi, trova gli oggetti usando l'intensità e fai scorrere la barra a destra del picco.
Per evitare detriti cellulari, escludere tutte le celle di diametro inferiore a 10 micrometri e superiore a 100 micrometri. Selezionare Ignora oggetti statici seguito da unifica automaticamente le tracce interrotte. Per salvare un nuovo protocollo, vai a Misurazioni.
Fare clic su Salva protocollo, seguito dal nome del nuovo protocollo. Nella scheda di misurazione, fai clic su misura tutti i punti temporali e ordina le tracce per intervallo di tempo, dal più alto al più basso. Dopo aver registrato i numeri ID delle tracce per le celle con tracce buone, esportare il file come testo separato da virgole e trasferire i dati al software di analisi desiderato.
Per eseguire il tracciamento manuale, apri l'immagine J, vai su plug-in e seleziona tracciamento e tracciamento manuale. Imposta gli intervalli di tempo X per Y, la dimensione dei pixel e la calibrazione Z. Quindi, fai clic su aggiungi traccia per avviare il monitoraggio delle singole celle.
Seleziona una cella al primo punto temporale e continua attraverso tutti i punti temporali. Infine, fai clic su termina traccia. Il monitoraggio cellulare assistito da software ha caratterizzato i comportamenti migratori delle singole cellule T attivate, come indicato dalle linee di colore diverso.
