Inclusione e criosezione del tessuto oculare in un composto a temperatura di taglio ottimale per l'imaging a fluorescenza

Dopo aver completato la crioprotezione dell'occhio di coniglio, trasferirlo da una soluzione di saccarosio al 30% a una capsula di dissezione da 100 millimetri. Sotto un microscopio da dissezione, capovolgere con cura l'occhio per rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte interna dell'occhio. Usando una salvietta, rimuovere delicatamente la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte esterna dell'occhio, riempire uno stampo da inclusione usa e getta con temperatura di taglio ottimale o composto OCT a una profondità compresa tra 0,5 e un centimetro.

Posizionare l'occhio nello stampo da inclusione rivolto verso l'alto e riempire lentamente la parte interna dell'occhio con il composto OCT, evitando la formazione di bolle. Una volta che l'occhio è emerso nel composto OCT e non tocca le superfici interne dello stampo, avvolgere lo stampo di inclusione nella paraffina e conservarlo a quattro gradi Celsius per una notte. Il giorno successivo, posizionare lo stampo per l'inclusione in una capsula di dissezione.

Se possibile, rimuovere delicatamente il composto OCT dall'interno dell'occhio con una salvietta. Trasferire l'occhio in un nuovo stampo da inclusione riempito con composto OCT fresco. Quindi riempire lo stampo come fatto in precedenza per assicurarsi che il mezzo di inclusione finale sia privo di detriti o imperfezioni.

Etichettare lo stampo a scopo di orientamento. Posiziona l'occhio verso l'alto nello stampo criogenico, in modo che il composto OCT rivesta la retina interna. Utilizzare la testa del nervo ottico come punto di riferimento per determinare la parte superiore dell'occhio Posizionare lo stampo di inclusione etichettato sul ghiaccio secco, assicurandosi che l'occhio non tocchi le superfici interne dello stampo o sia esposto all'aria.

Montare il blocco sul criostato con la parte superiore dell'occhio rivolta verso l'alto e la parte inferiore verso il basso. Con la cornea e l'iride rimanenti rivolte a destra o a sinistra. Posizionare una lama fresca parallelamente all'asse verticale dell'occhio per sezionarla.

Dopo aver tagliato le sezioni e asciugato per una notte, mettere un vetrino in congelatore a 80 gradi Celsius. Le immagini a fluorescenza di un'intera criosezione retinica dell'occhio di coniglio hanno dimostrato uno strato uniforme di epitelio pigmentato pigmentato della retina senza un distacco significativo dallo strato sovrastante del fotorecettore. Un'immagine in campo chiaro della sezione retinica dimostra ulteriormente la morfologia retinica intatta di tutti gli strati.