Grazie a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra per la consulenza tecnica. Questo studio è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia presso la USC Keck School of Medicine dalla ricerca per prevenire la cecità (AN), NIH K08EY030924 (AN), il Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), un premio per lo sviluppo della carriera (AN) per la ricerca per prevenire la cecità, Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e la Edward N. e Della L. Thome Memorial Foundation (AN, KG).

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Southern California. Quattordici (n = 14) conigli con cintura olandese di età compresa tra 4 e 6 mesi sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo. Venivano utilizzati sia animali maschi che femmine. Tutti gli animali pesavano tra 2,0 e 2,5 kg. Tutti gli animali erano alloggiati singolarmente. Un elenco dei materiali e delle attrezzature consigliate è disponibile nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione
<ol><li>Preparazione fissativa.<ol><li>Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Come minimo, sono necessari 50 ml di fissativo per occhio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dell'agente crioprotettivo.<ol><li>Preparare il 30% in peso in volume (p/v) di saccarosio in PBS. Porre su uno shaker per almeno 15 minuti per assicurarsi che il saccarosio sia completamente sciolto. Come minimo, sono necessari 50 ml di agente crioprotettivo per occhio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dello strumento di dissezione.<ol><li>Raccogli due paia di pinze, un paio di forbici curve, una lama di bisturi e un piatto di dissezione da 100 mm e posizionali vicino a un microscopio da dissezione. Un esempio di configurazione è mostrato nella Figura 1A.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fissazione iniziale
<ol><li>Dopo l'enucleazione transcongiuntivale11, posizionare immediatamente l'occhio in almeno 50 mL di PFA al 4% in PBS su ghiaccio. Assicurarsi che l'occhio sia completamente sommerso. Se si accumulano bolle d'aria sulla superficie esterna dell'occhio, rimuoverle agitando delicatamente.</li>
</ol>3. Rimozione della cornea e dell'iride
<ol><li>Dopo 15 minuti, rimuovere l'occhio dal 4% di PFA in PBS e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Riempi il piatto con PBS per evitare che l'occhio si secchi.</li>
	<li>Rimuovere la cornea.<ol><li>Iniziare creando un'incisione con una lama chirurgica 1 mm anteriormente al limbus, parallela al piano dell'iride per evitare di perforare accidentalmente le strutture sottostanti (Figura 1B).</li>
		<li>Inserire le forbici curve nell'incisione iniziale e continuare a tagliare circonferenzialmente rimanendo a 1 mm dal limbus. Utilizzare una pinza per stabilizzare l'occhio durante il taglio (Figura 1C).</li>
		<li>Una volta completato il taglio circonferenziale, rimuovere la cornea con una pinza e rimuovere delicatamente il PBS in eccesso con una salvietta da laboratorio. Posizionare la cornea in una soluzione di saccarosio al 30% a temperatura ambiente (RT) per la crioprotezione o scartarla. La crioprotezione è completa quando la cornea affonda, il che in genere richiede meno di 1 ora.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovi l'iride.<ol><li>Inizia facendo un taglio iniziale con le forbici curve attraverso l'iride. Separare completamente l'iride dal resto del tessuto tagliando circonferenzialmente in modo simile alla rimozione della cornea (Figura 1D).</li>
		<li>Una volta completato il taglio circonferenziale, rimuovere l'iride con una pinza e rimuovere delicatamente la PBS in eccesso con una salvietta da laboratorio. Posizionare l'iride in una soluzione di saccarosio al 30% a RT per la crioprotezione o scartare come sopra. La crioprotezione è completa quando l'iride affonda, che in genere richiede meno di 30 minuti.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Completamento del fissaggio
<ol><li>Con la cornea e l'iride rimosse, posizionare l'occhio in almeno 50 ml di PFA al 4% appena preparato in PBS e metterlo su uno shaker per un'agitazione delicata. Assicurarsi che l'occhio rimanga immerso durante l'agitazione.</li>
	<li>Tenere d'occhio il 4% di PFA in PBS a 4 °C durante la notte. NOTA: Abbiamo scoperto che il 4% di PFA si traduce in un'eccellente colorazione IHC se utilizzato tra 16 ore e 24 ore a 4 °C, con durate di fissazione più lunghe con conseguente aumento della colorazione di fondo aspecifica e del mascheramento degli epitopi.</li>
</ol>5. Rimozione dell'obiettivo
<ol><li>La mattina seguente, rimuovere l'occhio dal 4% di PFA in PBS e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Riempi il piatto con PBS per evitare che l'occhio si secchi.</li>
	<li>Rimuovere l'obiettivo.<ol><li>Inizia afferrando con cura la capsula anteriore del cristallino con una pinza. NOTA: Fare molta attenzione a non spingere o tirare con forza la lente con la pinza in quanto ciò può creare un distacco della retina.</li>
		<li>Inserire con cautela le forbici nella camera posteriore con le lame curvate posteriormente lungo la lente. Eseguire un taglio iniziale attraverso le zonule della lente con le forbici curve. NOTA: Fare molta attenzione a non spingere o tirare con forza le zonule con le forbici in quanto ciò può creare un distacco della retina (Figura 1E).</li>
		<li>Continuare a fare piccoli tagli attraverso le zonule della lente in uno schema circonferenziale. Fai da tre a cinque tagli per ora d'orologio.</li>
		<li>Per verificare se il cristallino è separato dal resto del tessuto, afferrare delicatamente la capsula anteriore del cristallino con una pinza e tentare di sollevarla delicatamente. Se la lente non si solleva immediatamente, non tentare di tirare di più in quanto ciò può creare un distacco della retina. Invece, fai più tagli attraverso le zonule rimanenti dell'obiettivo e riprova.</li>
		<li>Una volta separata dal resto del tessuto, posizionare la lente in una soluzione di saccarosio al 30% a RT per la crioprotezione o scartare come sopra. La crioprotezione è completa quando la lente affonda, il che in genere richiede alcune ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare l'occhio in almeno 50 ml di saccarosio al 30% in PBS a 4 °C per la crioprotezione. La crioprotezione è completa quando l'occhio affonda, il che richiede in genere 24-48 ore. Per accelerare la crioprotezione, sostituire la soluzione iniziale di saccarosio con una nuova dopo 8-12 ore e/o tenere l'occhio in soluzione di saccarosio a RT.</li>
</ol>6. Incorporamento
<ol><li>Una volta completata la crioprotezione, rimuovere l'occhio dalla soluzione di saccarosio al 30% e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Capovolgere con cura l'occhio in modo che sia rivolto verso il basso per rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte interna dell'occhio. NOTA: Non tentare di rimuovere la soluzione in eccesso dalla parte interna dell'occhio con una salvietta da laboratorio poiché la salvietta può attaccarsi al corpo vitreo e provocare un distacco della retina.</li>
	<li>Con l'occhio rivolto verso il basso, rimuovere delicatamente la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte esterna dell'occhio con una salvietta.</li>
	<li>Riempire uno stampo da inclusione monouso con un composto per temperatura di taglio ottimale (OCT) a una profondità di 0,5-1,0 cm. NOTA: Questa base assicura che l'occhio non tocchi il fondo dello stampo, il che interferisce con la criosezione successiva.</li>
	<li>Posizionare l'occhio nello stampo da inclusione monouso rivolto verso l'alto. Riempire lentamente la parte interna dell'occhio con OCT, prestando particolare attenzione per evitare la formazione di bolle all'interno dell'occhio. Se si formano delle bolle, rimuoverle con cura o spingerle fino al bordo dello stampo usando una pinza.</li>
	<li>Termina di riempire lo stampo da inclusione usa e getta con OCT. Assicurati che l'occhio sia completamente immerso nell'OCT e non tocchi le superfici interne dello stampo o sia esposto all'aria. Avvolgere lo stampo monouso per l'inclusione contenente l'occhio in OCT in parafilm; Porre a 4 °C per una notte. NOTA: Nella nostra esperienza, periodi di incubazione più brevi non consentono all'OCT di infiltrarsi completamente nel vitreo. Di conseguenza, uno strato di saccarosio rimane spesso tra la retina e l'OCT. Quando ciò si verifica, la retina spesso si stacca o si strappa completamente dal resto del tessuto durante la criosezione poiché il saccarosio congelato probabilmente fornisce meno supporto strutturale rispetto all'OCT congelato, rendendo difficili o addirittura impossibili ottenere sezioni di alta qualità.</li>
	<li>La mattina seguente, posizionare lo stampo di inclusione contenente l'occhio in OCT in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Verificare che la membrana ialoide posteriore appaia sollevata verso l'alto dalla retina interna. NOTA: Questo sollevamento verso l'alto può oscurare la visione della retina, rendendo difficile determinare l'orientamento.</li>
	<li>Per determinare meglio l'orientamento dell'occhio, afferrare con attenzione la membrana ialoide posteriore anteriormente e tentare di staccarla con una pinza per esporre la retina sottostante mentre si è in OCT. NOTA: A volte, può essere visibile il canale ialoide, che si attacca alla testa del nervo ottico e può essere utilizzato per scopi di orientamento poiché la testa del nervo ottico si trova nella parte superiore della retina (Figura 2A). Non è necessario rimuovere completamente la membrana ialoide posteriore poiché l'OCT si è già infiltrato nel corpo vitreo per rivestire la retina interna e l'eventuale membrana rimanente non influenzerà la criosezione (Figura 2B). La membrana ialoide posteriore deve essere rimossa solo per l'orientamento, se necessario. Altre opzioni per determinare l'orientamento includono il posizionamento di una sutura o di un altro tipo di segno prima dell'enucleazione.</li>
	<li>Trasferire l'occhio in un nuovo stampo da inclusione con nuovo OCT riempito a una profondità di 0,5-1,0 cm e quindi riempire con nuovo OCT come nei passaggi 6.3-6.5 per garantire che il mezzo di inclusione finale sia privo di detriti e/o altre imperfezioni che potrebbero essersi accumulate durante la notte. Se possibile, rimuovere delicatamente l'OCT con una salvietta anche dall'interno dell'occhio, anche se questo non è necessario.</li>
	<li>Etichettare lo stampo a scopo di orientamento (Figura 2C). Orientare l'occhio con l'occhio rivolto verso l'alto nello stampo criogenico assicura che l'OCT rilineerà la retina interna. Il canale ialoide, che si attacca alla testa del nervo ottico, è un punto di riferimento importante per determinare la parte superiore dell'occhio (Figura 2A).</li>
	<li>Posizionare lo stampo da inclusione etichettato contenente l'occhio nell'OCT sopra il ghiaccio secco. Assicurarsi che l'occhio non tocchi nessuna delle superfici interne dello stampo di inclusione o sia esposto all'aria. Assicurarsi che lo stampo tocchi direttamente il ghiaccio secco per accelerare il processo di congelamento (Figura 2D).</li>
	<li>Trasferire l'occhiello incorporato in un congelatore a -80 °C o direttamente nel criostato per il sezionamento (Figura 2E).</li>
</ol>7. Criosezione
<ol><li>Montare il blocco con la parte superiore dell'occhio rivolta verso l'esterno e la parte inferiore dell'occhio rivolta verso il basso, con la cornea e l'iride rimanenti rivolte a destra (come nella Figura 2E) o a sinistra (non mostrata). In alternativa, montare il blocco con un orientamento diverso, a seconda delle esigenze. Se necessario, rompere lo stampo per mobilizzare il blocco rompendo con cura ogni lato dello stampo uno alla volta e segnando direttamente il blocco per non perdere l'orientamento dell'occhio.</li>
	<li>Lasciare che il blocco si equilibri alla temperatura all'interno del criostato per 30-60 minuti; -20 °C è un buon punto di partenza.</li>
	<li>Una volta montata, posizionare una lama nuova all'angolazione desiderata, tipicamente parallela all'asse verticale dell'occhio.</li>
	<li>Impostare lo spessore della sezione come desiderato: le sezioni spesse 10-20 μm sono un buon punto di partenza. Un esempio di sezione spessa 14 μm è illustrato nella Figura 3A-C.<ol><li>In modo lento e controllato, inizia a sezionare il blocco. Assicurarsi che la lama stia tagliando il blocco parallelamente all'asse verticale dell'occhio. In caso contrario, regolare l'angolo in cui la lama entra in contatto con il blocco o l'orientamento del tavolino di conseguenza.</li>
		<li>Durante il sezionamento del blocco, evitare che la sezione si raggrinzisca o si arricci con una spazzola. Capovolgi rapidamente la sezione e applica una leggera pressione verso il basso con una spazzola a pelo lungo per appiattire la sezione e ridurre al minimo le rughe o l'arricciamento. Modellare un pennello separato con una punta appuntita per facilitare la manipolazione della sezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissare la sezione a un vetrino caricato spostando lentamente il vetrino rivolto verso il basso verso la sezione. Evitare che la sezione si pieghi su se stessa o si deformi in altro modo durante il fissaggio facendo rotolare delicatamente il vetrino sulla sezione. NOTA: Non posizionare la diapositiva direttamente sopra la sezione o premerla contro la sezione in quanto ciò potrebbe danneggiare o distorcere la sezione.</li>
	<li>Lasciare asciugare i vetrini per una notte prima di trasferirli in un congelatore a -80 °C o procedere direttamente a un protocollo di immunofluorescenza standard.</li>
</ol>

Dissezione e criosezione dell'occhio di coniglio per studi di immunoistochimica

<ol>
	<li>Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19-Models+in+ophthalmology+and+vision+research.">Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research.</a> American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).</li><li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit.">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li><li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+models+of+ocular+diseases:+New+relevance+for+classical+approaches.">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS &amp; Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology,+immunofluorescence,+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing.">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).</li><li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies.">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+in+companion+animals.">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li><li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs.">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).</li><li>Baiza-Dur&#225;n, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+(PRO-169)+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits.">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits.">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li><li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit.">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l'elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l'IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.
Una considerazion...

La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all'interno dell'occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.
I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell'anatomia agli occhi umani 1,2. Ad esempio, i conigli hanno un'area di maggiore densità dei fotorecettori, nota come striscia visiva orizzontale, che è analoga alla fovea negli esseri umani. Altri modelli animali di uso comune, come i roditori, non hanno un equivalente anatomico. Inoltre, rispetto ai roditori, la vascolarizzazione retinica nei conigli è abbastanza simile a quella dell'uomo. Anche gli occhi di coniglio sono relativamente grandi. Ciò li rende particolarmente adatti per studi che prevedono la somministrazione di farmaci o interventi chirurgici all'interno del vitreo o della retina che altrimenti potrebbero essere difficili o impossibili in un occhio più piccolo3.
L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno di un tessuto e ha ampie applicazioni nella ricerca retinica 4,5,6. Poiché la retina è una struttura delicata, ottenere risultati utili tramite IHC richiede un'attenta elaborazione dei tessuti. Il distacco della retina e altri artefatti tissutali come rotture o pieghe retiniche si verificano comunemente durante l'elaborazione e possono interferire con l'interpretazione dei risultati. Il successo dell'elaborazione dipende da una varietà di fattori, tra cui la manipolazione dei tessuti, il tipo e la durata della fissazione, il tipo di terreno di inclusione e le tecniche di sezionamento 7,8,9,10. Nonostante i vantaggi dell'utilizzo dei conigli come modello animale nella ricerca retinica, esistono pochissimi protocolli che descrivono il successo dell'elaborazione tissutale della retina del coniglio. Questo articolo descrive un metodo affidabile per ottenere sezioni retiniche di alta qualità da occhi di coniglio interi per l'uso nell'IHC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-106</td>
			<td>For fixation and cryoprotection (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Cover</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SOX2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-profile disposable cryostat blades</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>14035838926</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td>Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-RPE65</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NB100-355SS</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>167117</td>
			<td>Used for cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td>Used as embedding mold (step 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 15</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Used as embedding media (step 6)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eye 

Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l'enucleazione, l'occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l'iride vengono rimosse e l'occhio viene lasciato per una notte per un'ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L'occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l'occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l'incubazione notturna, l'occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l'uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno del tessuto retinico. L'adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l'immunoistochimica.

The retina is composed of several layers of specialized cells within the eye that together work to convert light into neural signals. Because the retina plays a critical role in vision, understanding its structure and function can provide valuable insights into some of the most common causes of vision loss such as macular degeneration and diabetic retinopathy, among others.
Rabbits serve as a convenient animal model in retinal research as they offer several advantages compared to other models. Rabbit eyes are relatively similar in anatomy to human eyes1,2. For example, rabbits have an area of increased photoreceptor density, known as the horizontal visual streak, that is analogous to the fovea in humans. Other commonly used animal models, such as rodents, do not have an anatomic equivalent. In addition, compared to rodents, the retinal vasculature in rabbits is fairly similar to that in humans. Rabbit eyes are relatively large as well. This makes them particularly suitable for studies that involve drug administration or surgical intervention within the vitreous or retina that may otherwise be difficult or impossible in a smaller eye3.
Immunohistochemistry (IHC) is a widely used technique to study the localization of antigens within a tissue and has broad applications in retinal research4,5,6. Because the retina is a delicate structure, obtaining useful results via IHC requires careful tissue processing. Retinal detachment and other tissue artifacts such as retinal breaks or folds commonly occur during processing and may interfere with the interpretation of results. Successful processing depends on a variety of factors, including tissue manipulation, type and duration of fixation, type of embedding media, and sectioning techniques7,8,9,10. Despite the advantages of using rabbits as an animal model in retinal research, very few protocols describing successful tissue processing of the rabbit retina exist. This paper describes a reliable method for obtaining high-quality retinal sections from whole rabbit eyes for use in IHC.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dell'elaborazione del tessuto retinico per l'immunoistochimica in modelli di coniglio

Ottenere criosezioni di alta qualità dell'intero occhio di coniglio 

Our research focuses on novel approaches to regenerating the retinal pigment epithelium. Dysfunction of the retinal pigment epithelium is thought to play a central role in the pathophysiology of many eye diseases, such as macular degeneration, so regenerating this layer of cells is attractive from a therapeutic standpoint. Visualizing the structural anatomy of the retina via immunohistochemistry has wide applications in retinal research.In our laboratory, we found obtaining useful results from rabbit eyes, difficult due to tissue artifacts like retinal attachments and retinal folds. Despite these challenges, there are very few protocols existing that describe successful tissue processing of rabbit retina. This protocol makes several important modifications to standard tissue processing techniques that result in excellent tissue sections of the rabbit retina.This study may allow researchers to obtain better results from their research that involves the use of immunohistochemistry in rabbit models.

Dopo l'elaborazione dei tessuti, un protocollo standard di immunofluorescenza può essere utilizzato per studiare un numero qualsiasi di processi biologici all'interno della retina. Le figure 3A-C illustrano immagini a fluorescenza rappresentative di una sezione retinica ottenute tramite microscopia confocale. La sezione retinica è stata immunocolorata secondo un protocollo12 precedentemente descritto.
Le ...

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Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell'occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l'uso in qualsiasi studio che utilizza l'immunoistochimica negli occhi più grandi.

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

La nostra ricerca si concentra su nuovi approcci per rigenerare l'epitelio pigmentato retinico. Si ritiene che la disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico svolga un ruolo centrale nella fisiopatologia di molte malattie oculari, come la degenerazione maculare, quindi la rigenerazione di questo strato di cellule è attraente da un punto di vista terapeutico. La visualizzazione dell'anatomia strutturale della retina tramite l'immunoistochimica ha ampie applicazioni nella ricerca retinica.Nel nostro laboratorio, abbiamo scoperto che ottenere risultati utili dagli occhi di coniglio, è difficile a causa di artefatti tissutali come gli attacchi retinici e le pieghe retiniche. Nonostante queste sfide, esistono pochissimi protocolli che descrivono il successo dell'elaborazione tissutale della retina di coniglio. Questo protocollo apporta diverse importanti modifiche alle tecniche standard di elaborazione dei tessuti che si traducono in eccellenti sezioni di tessuto della retina del coniglio.Questo studio può consentire ai ricercatori di ottenere risultati migliori dalla loro ricerca che prevede l'uso dell'immunoistochimica in modelli di coniglio.

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Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye 

1.1K Views.  University of Southern California. La nostra ricerca si concentra su nuovi approcci per rigenerare l'epitelio pigmentato retinico. Si ritiene che la disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico svolga un ruolo centrale nella fisiopatologia di molte malattie oculari, come la degenerazione maculare, quindi la rigenerazione di questo strato di cellule è attraente da un punto di vista terapeutico. La visualizzazione dell'anatomia strutturale della retina tramite l'immunoistochimica ha ampie applicazioni nella ricerca retinica.

Video: Autore in primo piano: Ottimizzazione dell'elaborazione del tessuto retinico per l'immunoistochimica in modelli di coniglio

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed in the fixative. Then, the cornea and iris are removed and the eye is left overnight for additional fixation at 4 &#176;C. Following fixation, the lens is removed. The eye is then placed in a cryomold and filled with an embedding medium. By removing the lens, the embedding medium has better access to the vitreous and leads to better retinal stability. Importantly, the eye should be incubated in embedding medium overnight to allow complete infiltration throughout the vitreous. Following overnight incubation, the eye is frozen on dry ice and sectioned. Whole retinal sections may be obtained for use in immunohistochemistry. Standard staining protocols may be utilized to study the localization of antigens within the retinal tissue. Adherence to this protocol results in high-quality retinal cryosections that may be used in any experiment utilizing immunohistochemistry.

This protocol describes a reliable method for obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eyes. It details rabbit eye dissection, fixation, embedding, and sectioning procedures, which may be easily adapted for use in any study utilizing immunohistochemistry in larger eyes.

Ricerca

Biologia

Whole Rabbit Eye Dissection and Ocular Tissue Preparation for Histological Analysis

After transconjunctival enucleation of the rabbit eye, immediately place in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and PBS on ice. After 15 minutes, transfer the eye to a 100 millimeter dissection dish and fill the dish with PBS to prevent the eye from drying out. Under a dissection microscope, Using a surgical blade, start making an incision one millimeter anterior to the limbus, keeping it parallel to the iris plane.Insert curved scissors into the initial incision and continue cutting circumferentially, maintaining a one millimeter distance from the limbus. Then remove the cornea with forceps and gently wipe away PBS With a laboratory wipe. Place the cornea in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection.Make an initial cut with curved scissors through the iris. Then cut circumferentially around the eye, similar to the cornea removal, to separate the iris from the rest of the tissue. Remove the iris with forceps and gently wipe away excess PBS with the laboratory wipe.Place the iris in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. After removing the cornea and iris, place the eye in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and put it on a shaker for gentle agitation. Leave the eye in 4%paraformaldehyde at four degrees Celsius overnight.The next day, place the eye in a dissection dish and fill the dish with PBS. Under the dissection microscope, use forceps to carefully grasp the anterior lens capsule. Then carefully insert the scissors into the posterior chamber, orienting the blades posteriorly along the lens.Make an initial cut through the lens zonules with curved scissors. Continue making small cuts in a circumferential pattern through the lens zonules. To confirm lens removal, gently grasp the anterior lens capsule with forceps and attempt to lift it.Upon separation, place the lens in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. Place the eye in 50 milliliters of 30%sucrose and PBS at four degrees Celsius for 24 to 48 hours for cryoprotection. To expedite cryoprotection, replace the initial sucrose solution with a fresh one after eight to 12 hours.

Dissezione dell'occhio intero di coniglio e preparazione del tessuto oculare per l'analisi istologica

Ocular Tissue Embedding and Cryosectioning in Optimal Cutting Temperature Compound for Fluorescence Imaging 

After cryo protection of the rabbit eye is complete, transfer it from a 30%sucrose solution to a 100 millimeter dissection dish. Under a dissecting microscope, carefully flip the eye to remove excess sucrose solution from the inner part of the eye. Using a wipe, gently wipe away excess sucrose solution from the outer part of the eye, fill a disposable embedding mold with optimal cutting temperature or OCT compound to a depth of 0.5 to one centimeter.Place the eye in the embedding mold facing upward and slowly fill the inner part of the eye with OCT compound, avoiding bubble formation. Once the eye is emerged in the OCT compound, and does not touch the inner surfaces of the mold, wrap the embedding mold in paraffin and store it at four degrees Celsius overnight. The next day, place the embedding mold in a dissection dish.If possible, gently remove the OCT compound from the inside of the eye with a wipe. Transfer the eye to a new embedding mold filled with fresh OCT compound. Then fill the mold as previously done to ensure the final embedding medium is free of debris or imperfections.Label the mold for orientation purposes. Position the eye upward in the cryo mold, so the OCT compound lines the inner retina. Use the optic nerve head as a landmark for determining the superior part of the eye Place the labeled embedding mold on dry ice, ensuring that the eye is not touching the inner surfaces of the mold or exposed to air.Mount the block on the cryostat with the superior part of the eye facing up and the inferior part down. With the remaining cornea and iris facing to the right or left. Position a fresh blade parallel to the vertical axis of the eye to section it.After cutting the sections and drying overnight, place a slide in a freezer at 80 degrees Celsius. The fluorescence images of a whole retinal cryosection of rabbit eye demonstrated a uniform pigmented retinal pigment epithelium layer without significant detachment from the overlying photoreceptor layer. A bright-field image of the retinal section further demonstrates intact retinal morphology of all layers.