Per iniziare, raccogli i campioni scongelati di tessuti murini infetti da Salmonella con un paio di pinzette. Inserirlo velocemente sul fondo di uno stampo di plastica contenente agarosio liquido. Una volta completata la polimerizzazione, utilizzare un bisturi per aprire lo stampo in plastica dagli angoli.
Dopo aver posizionato una lama su un microtomo, trasferire il campione con le dita guantate in una scatola per campioni. Posizionare il campione sotto il microtomo in modo che la superficie superiore dell'agarosio sia allo stesso livello della lama del microtomo. Sposta il tavolino per posizionare il cubo di agarosio al centro dell'obiettivo.
Fare clic sul pulsante Taglia nel software del tomografo fino ad ottenere un'intera fetta intatta del cubo. Quindi, centrare la lente dell'obiettivo sul campione di tessuto nelle direzioni x e y. Avvia il software del laser, regola la lunghezza d'onda a 800 nanometri, quindi accendi il laser.
Chiudere le porte dell'armadio del microscopio. Quindi spegni tutte le fonti di luce nella stanza. Accendere i PMT e impostare la tensione a 750 volt.
Ora imposta l'otturatore del microscopio su automatico. Quindi impostare le tensioni di V1 e V2 rispettivamente su 20 e 1,71. Regolare l'asse z con il dispositivo piezoelettrico z fino a raggiungere la superficie del tessuto.
Tagliare più fette di 50 micrometri di spessore. Successivamente, per trovare i bordi del campione, confinare l'area di imaging al tessuto con un'immagine minima dell'agarosio circostante. Dopo aver spento i PMT, impostare la lunghezza d'onda del laser a 800 nanometri.
Usa lo spot laser per trovare le coordinate dei bordi del tessuto mentre sposti il tavolino. Dopo aver confermato le coordinate, posizionare il punto laser al centro anteriore destro. Ora cambia la lunghezza d'onda a 940 nanometri.
Impostare l'otturatore del microscopio in modalità automatica, quindi impostare la tensione dell'otturatore su 20 per V1 e 1,71 per V2. Premere l'opzione di impostazione Mosaico 3D per avviare la scansione. Dopo l'imaging, raccogliere le sezioni di tessuto dal serbatoio dell'acqua. Per unire le immagini delle tessere, trasferire prima i dati dal server del tomografo al computer Linux.
Apri lo script MATLAB StepOneStitchingAndArchive. m e individuare la cartella di origine. Passa alla scheda Editor e fai clic su Esegui.
Le informazioni sullo stato di avanzamento verranno visualizzate nella finestra di comando. Trova le immagini unite nella sottocartella chiamata stitchedimages_100 nella cartella di origine. Comprimi i dati grezzi utilizzando il comando tar e salvali come un singolo file con l'estensione tar.bz2.
Per addestrare la macchina vettoriale di supporto, visualizza in anteprima le immagini cucite. Apri un'immagine con lo stesso nome file da ogni sottocartella con Fiji. Unisci i tre canali in un'unica immagine a colori, quindi regola la luminosità di ciascun canale fino a quando non vengono visualizzati segnali chiari dai batteri e dall'autofluorescenza dei tessuti.
Annotare il livello di intensità massimo regolato di ciascun canale. Quindi, apri lo script MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Definisci la cartella di origine e i nomi delle immagini per l'addestramento, quindi vai alla scheda Editor e fai clic su Esegui.
Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che richiede le soglie di colore, riempirla con i valori basati sul precedente controllo manuale con le Figi. Seleziona le regioni per lo sfondo e le regioni di interesse in base alle finestre di dialogo. Verranno visualizzati grafici che mostrano il livello di training del modello e chiedono se è necessario aggiungere altre aree.
Aggiungi più regioni di interesse e sfondo fino a quando i batteri possono essere chiaramente segmentati. Il processo di segmentazione verrà eseguito automaticamente e l'avanzamento può essere visualizzato nella finestra di comando. Quindi, apri le immagini del canale blu, che contiene i segnali di seconda armonica del collagene.
Piega le immagini del primo canale di dieci volte su entrambi gli assi x e y e salva le immagini ridimensionate in una nuova cartella. Crea tre repliche di immagini ridimensionate all'interno della stessa cartella. Per la visualizzazione 3D avviare il pacchetto software di visualizzazione Imaris nella vista Arena.
Ora apri il file IMS o TIF. Regolare le rappresentazioni dei colori dei diversi canali nella finestra di regolazione dello schermo. Fare clic su Proprietà immagine nel menu Modifica per impostare manualmente i valori minimo o massimo e un valore per la correzione gamma.
Dopo aver regolato l'aspetto dell'immagine, esportare la vista corrente utilizzando lo strumento Istantanea. Utilizza il puntatore di navigazione per trovare una visualizzazione, quindi utilizza più Aggiungi per aggiungere fotogrammi chiave. Utilizzare l'icona Animazione per rappresentare i dati 3D come un filmato.
Premere il pulsante rosso di registrazione per creare il filmato, quindi salvarlo nella cartella di destinazione e nel tipo di file desiderati. Singole cellule di Salmonella sono state rilevate in interi organi di topo, come la milza, il fegato, i linfonodi mesenterici e le chiazze di Peyer. La segmentazione dei batteri fluorescenti è stata confermata dall'immunoistochimica.
Le cellule ospiti sono state colorate in vivo iniettando un anticorpo ai marcatori di superficie prima della perfusione.
