Per iniziare, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 50 millilitri e inserire un filtro sterile da 0,45 micrometri in polietersulfone a basso legame proteico o un filtro sterile da 0,45 micrometri di fluoruro di polivinilidene. Utilizzando uno Stripette sierologico da 25 millilitri, aggiungere il lentivirus trasfettato HEK293T sospensione cellulare nella siringa e rimettere delicatamente lo stantuffo. Spingere lentamente lo stantuffo e raccogliere il filtrato in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Una volta fatto, rimuovere il filtro dalla siringa e smaltirlo nella soluzione decontaminante. Aggiungere tre millilitri di una soluzione di saccarosio al 20% sul fondo della provetta dell'ultracentrifuga. Quindi, imposta il PIPETBOY alla velocità più bassa.
Tenere la provetta per ultracentrifuga a un angolo di circa 45 gradi e aggiungere lentamente il terreno filtrato contenente lentivirus sulla parete della provetta. Osservare la netta separazione degli strati dal tubo. Se il volume totale del tubo è inferiore a 29 millilitri, aggiungere cDMEM fresco per evitare che il tubo collassi durante la centrifuga.
Pulire il secchio dell'ultracentrifuga con alcol al 70% e inserire l'adattatore del tubo sul fondo del secchio. Quindi, posizionare la provetta per ultracentrifuga nel secchio. Chiudere il secchio e posizionarlo nella griglia.
Pre-raffreddare l'ultracentrifuga a quattro gradi Celsius. Posizionare con cautela il secchio nel rotore e accendere l'aspirapolvere. Regolare la velocità di accelerazione e decelerazione al minimo e centrifugare a 26.000 giri/min per 90 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, spegnere il vuoto e rimuovere con cautela il rotore senza disturbare i campioni. Osservare l'ultracentrifuga per verificare che non vi siano fuoriuscite e perdite dai secchi. Versare il contenuto di una provetta per ultracentrifuga con un movimento fluido nel contenitore dei rifiuti.
Capovolgere il tubo su un fazzoletto di carta velina a doppio strato per 10 minuti. Nel frattempo, pulisci l'interno del secchio con carta velina imbevuta di etanolo al 70% e asciugalo all'aria capovolto. Utilizzando carta velina, asciugare accuratamente il liquido rimanente dal bordo della provetta dell'ultracentrifuga.
Risospendere il pellet in un millilitro di terreno appropriato senza siero e lasciarlo agire per 15 minuti. Utilizzando una pipetta da un millilitro, mescolare delicatamente i preparati di lentivirus e aliquotarli in provette da 1,5 millilitri con tappo a vite. Conservare i preparati lentivirali a meno 80 gradi Celsius.
Il successo della preparazione del lentivirus ha raggiunto un tasso di infezione di oltre il 95% con una dose di cinque microlitri. L'intensità media fluorescente delle cellule infette aumenta con dosi più elevate. L'iniezione intraperitoneale di 100 microlitri di preparato di lentivirus ha prodotto la più alta percentuale e intensità del segnale GFP nelle cellule peritoneali dei topi.
Gli esperimenti con iniezione di lentivirus da 100 microlitri hanno rivelato una percentuale significativa di cellule residenti che esprimono GFP al terzo e al settimo giorno, seguite dalla scomparsa della popolazione infetta al giorno 14.
