Iniziare posizionando l'animale anestetizzato sulla piattaforma chirurgica. Applicare un unguento lubrificante sugli occhi di ogni animale per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'intervento chirurgico. Disinfettare il sito chirurgico rasato con tre cicli alternati di iodio povidone e isopropanolo.
Quindi posiziona un rotolo di carta assorbente o un tubo di 1,5 centimetri di diametro sotto l'animale appena rostrale ai fianchi. Drappeggiare l'animale con un telo fenestrato, centrando la fenestrazione sulla colonna lombare per l'accesso chirurgico. Per verificare la profondità dell'anestesia nell'animale, pizzicare ciascuna zampa e osservare l'assenza di qualsiasi risposta di astinenza.
Quindi, utilizzando una lama di bisturi numero 11, praticare un'incisione cutanea lunga tre centimetri lungo la linea mediana dalle vertebre L2 a L6. Ora inserisci un paio di forbici chirurgiche curve sterili tra il muscolo e la pelle e apri delicatamente le punte per separare la pelle dal muscolo sottostante. Rimuovere la fascia che copre i processi spinosi delle vertebre da L2 a L5.
Pipettare da 25 a 35 microlitri del vettore AAV9 nel tappo di una provetta sterile per microcentrifuga. Aspirare l'intero volume del vettore dal tappo alla siringa da insulina. Quindi identificare i processi spinosi L5 e L4 sull'animale.
Posizionare l'ago della siringa a sinistra del processo spinoso L5, allineandolo con l'estremità caudale del processo. Far avanzare l'ago della siringa in avanti di circa otto millimetri sopra la lamina L5, quindi sotto la lamina L4 nella cassetta lombare fino a quando non viene toccato l'osso. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per circa cinque secondi.
Quindi estrarre lentamente l'ago dal sito di inserimento. Usando una sutura 4-0 o graffette chirurgiche, inizia a chiudere l'incisione a un'estremità della ferita. Per valutare il successo dell'iniezione di colorante, dopo l'eutanasia dell'animale, praticare un'incisione lunga quattro centimetri nel muscolo parallelamente alla colonna vertebrale su entrambi i lati dei processi spinosi.
Usa una pinza per la colonna vertebrale o le forbici per rimuovere delicatamente il muscolo tra i processi spinosi. utilizzando un rongeur, estrarre i processi spinosi dalla L6 alla colonna vertebrale toracica inferiore. Inserire la punta inferiore del rongeur sotto la lamina L5 e rimuovere metodicamente l'osso sovrastante il midollo spinale prelevando diversi morsi.
