Per iniziare, ottenere la regione lombare della spina dorsale del cucciolo in un piatto contenente un mezzo di dissezione freddo. Utilizzando uno stereomicroscopio da dissezione e microforbici, tagliare la spina dorsale lungo l'asse sagittale. Con una pinzetta dritta, rimuovere delicatamente il midollo spinale dalla cavità della spina dorsale e staccare con cura le meningi dalla regione lombare isolata del midollo spinale, o SC. Trasferire e incubare la regione lombare SC isolata in un terreno di dissezione freddo e fresco per 10-15 minuti.
Utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, posizionare il fazzoletto sul piatto di taglio dello strumento tritatutto perpendicolarmente alla lama. Dopo aver rimosso il mezzo di dissezione residuo, procedere con il sezionamento automatizzato della SC. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire le fette e incubarle con terreno di dissezione fresco in un piatto da 35 millimetri per 15 minuti. Lavare tre volte la superficie dell'inserto della membrana di coltura con un terreno organotipico, o OM, e lasciare un millilitro di terreno sul fondo dell'inserto della membrana.
Esaminare le fette sotto lo stereomicroscopio di dissezione e seminare il numero desiderato di fette sugli inserti della membrana condizionati. Dopo aver regolato l'orientamento delle fette e rimosso il terreno in eccesso, incubarle a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, trasferire l'inserto in una nuova piastra di Petri e aggiungere un millilitro di OM fresco integrato con GDNF nella parte inferiore dell'inserto a membrana.
Incubare le fette a 37 gradi Celsius. Il giorno ex vivo uno, sostituire il vecchio mezzo con OM fresco. Il terzo giorno, passare al terreno di innesto integrato con GDNF e aggiungere GDNF fresco al terreno ogni giorno fino al settimo giorno. Per il resto della coltura a lungo termine, aggiungere GDNF solo quando si cambia il terreno.
Il test di immunofluorescenza di fette organotipiche di SC di topo in coltura a lungo termine ha rivelato un'ampia distribuzione del neurofilamento marcatore citoscheletrico e del marcatore neuronale nucleare RBFOX3, attestando la loro condizione di salute e identità neuronale.
