Per iniziare, assumere cellule RSC96 stimolate elettricamente in piastre di coltura. Quindi, utilizzare una penna istologica per disegnare cerchi nei punti in cui le cellule sono distribuite uniformemente sul vetrino coprioggetti. Aggiungere da 50 a 100 microlitri di soluzione di lavoro per permeabilizzazione alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Quindi, aggiungere il 3% di BSA all'interno dei cerchi per coprire uniformemente il tessuto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, rimuovere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario opportunamente diluito alle cellule.
Posizionare la piastra di coltura cellulare in una scatola umida e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna agitando continuamente. Aggiungere l'anticorpo secondario corrispondente e incubare a temperatura ambiente per 50 minuti.
Al termine dell'incubazione, posizionare il vetrino coprioggetto nel PBS e lavarlo tre volte agitando per cinque minuti ciascuna. Quindi, lasciare asciugare il vetrino e aggiungere la soluzione colorante DAPI al vetrino asciutto. Infine, sigillare il vetrino coprioggetto essiccato con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per la fluorescenza.
Acquisisci immagini utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione specifiche per Alexa Fluor 488, SCI3 e SCI5. L'analisi microscopica ha mostrato cellule citoplasmatiche beta positive S-100 sparse in rosso in tutti i gruppi e un aumento della densità ottica integrata della fluorescenza beta S-100 è stato osservato nel gruppo di cinque kilovolt per centimetro rispetto ai gruppi di controllo e 10 kilovolt per centimetro. In tutti i gruppi sono state osservate cellule GFAP e Sox10-positive con citoplasma diffuso durante i saggi di scansione cellulare.
Tuttavia, l'espressione di GFAP era significativamente più bassa nel gruppo di cinque kilovolt per centimetro rispetto ai gruppi di controllo e 10 kilovolt per centimetro. Le cellule RSC96 nel gruppo dei cinque kilovolt per centimetro hanno mostrato un valore medio di grigio significativamente più alto dell'espressione di Sox10, suggerendo una maggiore espressione di Sox10.
