Questo lavoro è stato finanziato dal National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (NO.82027803).

1. Scongelamento di cellule RSC96 crioconservate
<ol><li>Scongelare il crioviale contenente 1 mL di sospensione cellulare agitandolo rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C, quindi aggiungerlo a una provetta da centrifuga contenente 4-6 mL di terreno di coltura completo e mescolare bene.</li>
	<li>Centrifugare a 1000 x g per 3-5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 3 mL di terreno di coltura completo.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione cellulare a un pallone di coltura (o piatto) contenente 6-8 mL di terreno di coltura completo e incubare a 37 °C per una notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, osserva la crescita e la densità cellulare al microscopio.</li>
</ol>2. Passaggio cellulare:
NOTA: Se la densità della cella raggiunge l'80%-90%, è pronta per il passaggio.
<ol><li>Eliminare il terreno di coltura e sciacquare le cellule 1-2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza ioni calcio e magnesio.</li>
	<li>Aggiungere lo 0,25% (p/v) di tripsina-0,53 mM EDTA al pallone di coltura (1-2 mL per un pallone T25, 2-3 mL per un pallone T75) e incubare a 37 °C per 1-2 min.</li>
	<li>Osservare il distacco cellulare al microscopio. Se la maggior parte delle cellule diventa rotonda e si stacca, riportare rapidamente il pallone nell'area di lavoro, picchiettare delicatamente il pallone e aggiungere 3-4 mL di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per fermare la digestione.</li>
	<li>Mescolare il contenuto, aspirare la soluzione e centrifugare a 1000 x g per 5 min. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1-2 mL di terreno di coltura fresco e pipettando delicatamente.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25 in rapporto 1:2 e aggiungere 7 mL di terreno di coltura.</li>
</ol>3. Funzionamento del dispositivo nsPEF
<ol><li>Risospendere le cellule RSC96 in 1 mL di terreno di coltura DMEM e trasferirle in piastre colorimetriche con elettrodi su entrambi i lati.</li>
	<li>Accendere l'interruttore di alimentazione.</li>
	<li>Regolare i parametri ruotando la manopola sullo strumento per modificare l'intensità del campo elettrico. Le intensità stabilite in questo studio sono 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.</li>
	<li>Ruotare con cautela gli elettrodi fino a quando non compaiono scintille, consentendo alle celle di ricevere 5 impulsi di nsPEF in base alle intensità di campo preimpostate prima di separare immediatamente i due elettrodi. Dopo questo trattamento, prelevare le cellule del gruppo sperimentale trattate con nsPEF e le cellule del gruppo di controllo non trattate per eseguire le sezioni 4-6, rispettivamente, dopo un certo periodo di coltura cellulare (1 giorno in questo esperimento).</li>
</ol>4. Saggio del kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8)
<ol><li>Preparare una sospensione cellulare di una particolare concentrazione da cellule RSC96 stimolate con stimolazione elettrica. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti. Considerando i requisiti del test CCK-8, controllare il numero totale di cellule nel kit di reagenti tra 1 x 103 e 1 x 106.</li>
	<li>Prelevare 10 μL di soluzione CCK-8 dal kit e aggiungerli alla piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Incubare in un incubatore di CO2 a 37 °C per altri 30 minuti - 4 ore.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza. Utilizza la misurazione a doppia lunghezza d'onda con una lunghezza d'onda di rilevamento di 430-490 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 600-650 nm.</li>
	<li>Determinare l'intensità dell'intensità di campo per gli esperimenti successivi in base ai risultati sperimentali della proliferazione cellulare. Selezionare le cellule con una buona proliferazione per gli esperimenti successivi.</li>
</ol>5. Saggio di graffio cellulare
<ol><li>In ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti, seminare 3 x 105 celle con un volume totale di 2 mL per pozzetto. Circa 72 ore dopo, le celle copriranno il pozzo. Condurre il test sul gruppo sperimentale e su quello di controllo separatamente.</li>
	<li>Utilizzare la punta di una pipetta per tracciare una linea orizzontale sul fondo del pozzetto di coltura. Assicurarsi che il puntale della pipetta sia tenuto in verticale e cercare di evitare di inclinarlo.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e lavare con PBS 2-3 volte.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di terreno privo di siero in ogni pozzetto.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Scattare foto con un ingrandimento quadruplo del microscopio invertito a 0 ore e 24 ore per osservare i cambiamenti nella migrazione cellulare.</li>
</ol>6. Immunofluorescenza
<ol><li>Permeabilizzazione cellulare:<ol><li>Dopo aver pipettato delicatamente le sospensioni cellulari nei piatti di coltura, disegnare dei cerchi con un pennarello istologico nei punti in cui le cellule sono distribuite uniformemente sul vetrino coprioggetti. Trattare separatamente il gruppo di controllo e i diversi gruppi sperimentali.</li>
		<li>Aggiungere 50-100 μL di soluzione di lavoro per permeabilizzazione (0,25-0,5% Triton X-100) e incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 min. Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ogni volta.</li>
	</ol></li>
	<li>Blocco del siero: aggiungere il 3% di BSA all'interno dei cerchi per coprire uniformemente il tessuto. Incubare a RT per 30 min.</li>
	<li>Incubazione dell'anticorpo primario: rimuovere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario opportunamente diluito (derivato dal topo, diluito a 1:300) nei pozzetti cellulari. Collocare la piastra per colture cellulari in una scatola umida e incubare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Incubazione secondaria degli anticorpi: Posizionare la piastra cellulare su uno shaker e lavarla tre volte per 5 minuti ogni volta. Aggiungere l'anticorpo secondario corrispondente (IgG di capra anti-topo marcato con CY3, diluito a 1:300) e incubare a RT per 50 minuti.</li>
	<li>Colorazione nucleare DAPI:<ol><li>Posizionare il vetrino coprioggetti in PBS (pH 7,4) su uno shaker e lavare tre volte per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Dopo aver asciugato delicatamente il vetrino, aggiungere la soluzione di colorazione DAPI (2 μg/mL, 0,5 mL per cerchio) all'interno dei cerchi e incubare a RT per 10 minuti in una camera buia.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio: Posizionare il vetrino coprioggetti in PBS (pH 7,4) su uno shaker e lavare tre volte per 5 minuti ogni volta. Dopo aver asciugato delicatamente il vetrino, sigillare il vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per la fluorescenza.</li>
	<li>Acquisizione dell'immagine: eccitare DAPI a una lunghezza d'onda di 330-380 nm e rilevare l'emissione a 420 nm; eccitare a 465-495 nm e rilevare l'emissione a 515-555 nm per AF488; eccitare a 510-560 nm e rilevare l'emissione a 590 nm per CY3; eccitare a 608-648 nm e rilevare l'emissione a 672-712 nm per CY5.</li>
</ol>

Migliorare la rigenerazione dei nervi periferici con le cellule di Schwann stimolate da nsPEF

<ol>
	<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells.">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li><li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions.">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li><li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration.">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li><li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li><li>Lee, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL/collagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration.">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li><li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields:+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers.">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).</li><li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury.">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li><li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+regulates+mitochondrial+oxidative+stress+in+C2C12+myotubes+induced+by+electrical+stimulations+of+different+intensities.">AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).</li><li>Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. 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E., N&#250;&#241;ez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF):+Opening+the+biotechnological+Pandora's+box.">Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+nanoelectroablation+therapy+for+basal+cell+carcinoma:+proof+of+method.">First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method.</a> Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-thermal+nanoelectroablation+of+UV-induced+murine+melanomas+stimulates+an+immune+response.">Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).</li><li>Carr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF)+can+affect+membrane+permeabilization+and+cellular+viability+in+a+3D+spheroids+tumor+model.">A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).</li><li>Hornef, J., Edelblute, C. 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M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+regeneration.">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li><li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+(nsPEF).">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891 (2012).</li><li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth.">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).</li><li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro.">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).</li><li>Ho, T. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels:+Properties+and+applications+in+biomedicine.">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902 (2022).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi anni, l'applicazione di nsPEF ha registrato una crescita stimolante, come riportato. nsPEF ha un effetto altamente mirato solo sull'area desiderata, fornendo energia sufficiente per il trattamento senza causare ulteriori danni termici, rendendolo più sicuro per il corpo umano28. Queste caratteristiche gli conferiscono promettenti prospettive traslazionali nel trattamento dei tumori e nella rigenerazione nervosa. Tuttavia, alcuni studi hanno proposto alcune limitazioni di nsPEF. Rispe...

Ogni anno, milioni di persone sono colpite da lesioni nervose che coinvolgono sia il sistema nervoso periferico (SNP) che il sistema nervoso centrale (SNC)1. Gli studi hanno dimostrato che la capacità di riparazione assonale del SNC è piuttosto limitata dopo lesioni nervose, mentre il PNS mostra una maggiore capacità a causa della significativa plasticità delle SC2. Ciononostante, il raggiungimento della rigenerazione completa dopo lesioni dei nervi periferici rimane arduo e continua a rappresentare una sfida significativa per la salute umana 3,4. Al giorno d'oggi, gli autotrapianti sono rimasti un trattamento comune nonostante gli svantaggi della morbilità del sito donatore e della disponibilità limitata5. Questa situazione ha spinto i ricercatori a esplorare terapie alternative, tra cui i materiali6, i fattori molecolari7 e la stimolazione elettrica (ES). Come fattore che promuove la crescita assonale e la rigenerazione nervosa8, la scelta di un metodo appropriato di ES e l'esplorazione della relazione tra ES e SC diventano essenziali.
Le SC sono le principali cellule gliali del SNP e svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione del PNS 9,10. A seguito di lesioni dei nervi periferici, le SC subiscono una rapida attivazione, un'ampia riprogrammazione2 e la transizione da uno stato di formazione della mielina a una morfologia di supporto alla crescita per condurre la rigenerazione del nervo2. Una consistente proliferazione di SC si verifica all'estremità distale del nervo danneggiato, mentre le SC del moncone distale subiscono proliferazione e allungamento per formare la banda di Bungner, che sono necessarie per guidare gli assoni a crescere verso l'organo bersaglio11. Inoltre, le SC dei monconi nervosi prossimali e distali migrano nel ponte nervoso per formare cordoni SC che promuovono la rigenerazione degli assoni12. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che la sintesi e la secrezione di fattori rilevanti correlati alle SC cambiano nei casi di rigenerazione dei nervi periferici, inclusi i fattori trascrizionali13, i fattori neurotrofici14 e i regolatori della mielinizzazione13. Sulla base di questi, la promozione della proliferazione, della migrazione, della sintesi e della secrezione di fattori rilevanti per migliorare la rigenerazione dei nervi periferici 15 è stata ampiamente studiata per migliorare la rigenerazione dei nervi periferici15.
Studi precedenti hanno dimostrato la possibilità di utilizzare l'ES per la rigenerazione nervosa1. Una spiegazione ampiamente accettata è che l'ES può indurre la depolarizzazione delle membrane cellulari, alterare il potenziale di membrana e influenzare le funzioni delle proteine di membrana modificando le distribuzioni di carica su queste biomolecole1. Tuttavia, la PEF intensa ampiamente applicata può causare dolore intenso, contrazioni muscolari involontarie e fibrillazione cardiaca8. Aumenta anche l'attività della creatinchinasi (CK), diminuisce la forza muscolare e induce lo sviluppo di indolenzimento muscolare a insorgenza ritardata (DOMS)16. nsPEF è una tecnica emergente che stimola i soggetti del test con campi elettrici ad alta tensione entro una durata di impulso di nanosecondi e viene gradualmente utilizzata nella ricerca a livello cellulare17,18. Studi precedenti hanno riportato che il possibile razionale della nsPEF che promuove la proliferazione cellulare e l'attività degli organelli è la formazione di nanopori di membrana e l'attivazione dei canali ionici, che porta ad un aumento della concentrazione citoplasmatica di Ca2+ 19. nsPEF utilizza la tecnologia di alimentazione a impulsi per caricare la membrana cellulare, producendo impulsi caratterizzati da breve durata, tempo di salita rapido, alta potenza e bassa densità di energia20. Queste caratteristiche suggeriscono che la nsPEF potrebbe essere una modalità preferita con effetti collaterali di stimolazione minimi8. Inoltre, nsPEF offre vantaggi come procedure minimamente invasive, reversibilità, adattabilità e non distruttività dei tessuti neurali rispetto agli interventi chirurgici. Una delle principali direzioni di ricerca di nsPEF in campo biomedico è la sua applicazione per l'ablazione del tessuto tumorale utilizzando la stimolazione del campo elettrico ad alta energia 21,22,23. Alcuni risultati della ricerca indicano che il 12-nsPEF può stimolare i nervi periferici senza causare danni24. Tuttavia, al momento, ci sono prove limitate riguardo l'applicazione di nsPEF nel campo della rigenerazione nervosa. Inoltre, stimolare le SC utilizzando nsPEF è un tentativo pionieristico, che contribuisce a ulteriori ricerche cliniche e in vivo. Questo studio esplora se la stimolazione nsPEF delle SC può promuovere la rigenerazione nervosa e fornire una base affidabile per successive ricerche approfondite e sistematiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12144-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100 beta Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB14146-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GC305010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-labeled goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB21302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Reagent</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorizing shaker</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>DS-2S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Supply for nsPEF</td>
			<td>Matsusada Precision Inc.</td>
			<td>AU-60P1.6-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochemical pen</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane breaking liquid</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MS6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS powdered</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIKON ECLIPSE C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody</td>
			<td>Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>BS-20563R-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSC96 Schwann cells</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>STCC30007G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanister</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>Pannoramic MIDI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special cable for nsPEF</td>
			<td>Times Microwave Systems</td>
			<td>M17/78-RG217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbine mixer</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regulating schwann cell growth by nanosecond pulsed electric field for peripheral nerve regeneration in vitro

Le cellule di Schwann (SC) sono cellule mielinizzanti del sistema nervoso periferico, che svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione dei nervi periferici. Il campo elettrico a impulsi di nanosecondi (nsPEF) è un metodo emergente applicabile alla stimolazione elettrica nervosa che si è dimostrato efficace nello stimolare la proliferazione cellulare e altri processi biologici. Con l'obiettivo di valutare se le SC subiscono cambiamenti significativi nell'ambito della nsPEF e aiutare a esplorare il potenziale di nuovi metodi di rigenerazione dei nervi periferici, le cellule RSC96 in coltura sono state sottoposte a stimolazione con nsPEF a 5 kV e 10 kV, seguita da una coltivazione continua per 3-4 giorni. Successivamente, sono stati valutati alcuni fattori rilevanti espressi dalle SC per dimostrare il successo della stimolazione, tra cui la proteina marcatore specifica, il fattore neurotrofico, il fattore di trascrizione e il regolatore della mielinizzazione. I risultati rappresentativi hanno mostrato che la nsPEF ha migliorato significativamente la proliferazione e la migrazione delle SC e la capacità di sintetizzare fattori rilevanti che contribuiscono positivamente alla rigenerazione dei nervi periferici. Allo stesso tempo, una minore espressione di GFAP indicava la prognosi benigna delle lesioni dei nervi periferici. Tutti questi risultati mostrano che nsPEF ha un grande potenziale come metodo di trattamento efficiente per le lesioni dei nervi periferici stimolando le SC.

Each year, millions of people are affected by nerve injuries involving both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS)1. Studies have demonstrated that the axonal repair capacity of the CNS is quite limited after nerve injuries, while the PNS shows enhanced capacity due to the significant plasticity of SCs2. Nevertheless, achieving complete regeneration after peripheral nerve injuries remains arduous and continues to pose a significant challenge to human health3,4. Nowadays, autografts have remained a common treatment despite the drawbacks of donor site morbidity and limited availability5. This situation has prompted researchers to explore alternative therapies, including materials6, molecular factors7, and electrical stimulation (ES). As a factor promoting axonal growth and nerve regeneration8, choosing an appropriate method of ES and exploring the relationship between ES and SCs become essential.
SCs are the main glial cells of the PNS, playing a crucial role in the regeneration of the PNS9,10. Following peripheral nerve injuries, SCs undergo rapid activation, extensive reprogramming2,&#160;and transition from a myelin-forming state to a growth-supportive morphology to conduct the regeneration of the nerve2. A substantial proliferation of SCs occurs at the distal end of the injured nerve, while SCs of the distal stump undergo proliferation and elongation to form Bungner&#39;s band, which are necessary to guide axons to grow towards the target organ11. Moreover, SCs from the proximal and distal nerve stumps migrate into the nerve bridge to form SC cords promoting axon regeneration12. Furthermore, previous studies have demonstrated that the synthesis and secretion of relevant factors related to SCs change in cases of peripheral nerve regeneration, including transcriptional factors13, neurotrophic factors14, and myelination regulators13. This also provides indicators for assessing the activity of SCs. Based on these, the promotion of SC proliferation, migration, synthesis, and secretion of relevant factors have been extensively investigated for improving peripheral nerve regeneration15.
Previous studies have demonstrated the possibility of using ES for nerve regeneration1. A widely accepted explanation is that ES can induce depolarization of cell membranes, alter membrane potential, and affect membrane protein functions by changing the charge distributions on these biomolecules1. However, widely applied Intense PEF may cause severe pain, involuntary muscle contractions, and heart fibrillation8. It also increases creatine kinase (CK) activity, decreases muscle strength, and induces the development of delayed onset muscle soreness (DOMS)16. nsPEF is an emerging technique that stimulates test subjects with high-voltage electric fields within a nanosecond pulse duration, and it is gradually being used in cellular-level research17,18. Previous studies have reported that the possible rationale of nsPEF promoting cell proliferation and organelle activity is the formation of membrane nanopores and the activation of ionic channels, which leads to an increase in cytoplasmic Ca2+ concentration19. nsPEF utilizes pulse power technology to charge the cell membrane, producing pulses characterized by short duration, rapid rise time, high power, and low energy density20. These characteristics suggest that nsPEF may be a preferred mode with minimal stimulation side effects8. Furthermore, nsPEF offers advantages such as minimally invasive procedures, reversibility, adjustability, and non-destructiveness to neural tissues compared to surgical interventions. One mainstream research direction of nsPEF in the biomedical field is its application for tumor tissue ablation using high-energy electric field stimulation21,22,23. Some research results indicate that 12-nsPEF can stimulate peripheral nerves without causing damage24. However, at present, there is limited evidence regarding the application of nsPEF in the field of nerve regeneration. Moreover, stimulating SCs using nsPEF is a pioneering attempt, contributing to further in vivo and clinical research. This study explores whether nsPEF stimulation of SCs can promote nerve regeneration and provide a reliable basis for subsequent in-depth and systematic research.

Autore in primo piano: Uso innovativo di nsPEF per aumentare la rigenerazione dei nervi periferici

Regolazione della crescita delle cellule di Schwann mediante campo elettrico pulsato a nanosecondi per la rigenerazione dei nervi periferici in vitro

Our research focuses on promoting peripheral nerve regeneration by nsPEF stimulated swan cells. We hope to develop a new way to activate swan cells efficiently as nerve regeneration is quite difficult in most cases. We innovatively use a nanosecond post electric field nsPEF to activate swan cells.We are delighted to find that nsPEF may be a preferred mode for peripheral nerve regeneration with minimal stimulation side effects. Besides our protocol provide a reliable basis for subsequent in depth and systematic research. Our laboratory will continually explore the application of nsPEF.In terms of nerve regeneration, we will build up animal models to promote in vivo testing and evaluate the safety of nsPEF in vivo. As there is limited evidence regarding the application of nsPEF in referral nerve regeneration, we hope we can make breakthroughs.

I campi elettrici pulsati a bassa intensità stimolano la proliferazione cellulare Secondo il test CCK-8, il tasso di proliferazione di RSC96 nel gruppo 5 kV/cm era significativamente più veloce di quello delle cellule del gruppo di controllo. Tuttavia, all'aumentare dei parametri (20 kV/cm e 40 kV/cm), il tasso di proliferazione era instabile, persino inferiore a quello del gruppo di controllo. Il tasso di proliferazione cellulare delle cellule RSC96 nel gruppo 40 kV/cm era significativamente inferi...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Innovative Use of nsPEF to Boost Peripheral Nerve Regeneration at JoVE.com

Qui, presentiamo un protocollo per l'applicazione del campo elettrico a impulsi di nanosecondi (nsPEF) per stimolare le cellule di Schwann in vitro. La sintesi e la capacità di secrezione di fattori rilevanti e i cambiamenti del comportamento cellulare hanno convalidato il successo della stimolazione con nsPEF. Lo studio fornisce una visione positiva del metodo di rigenerazione dei nervi periferici.

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse ...

La nostra ricerca si concentra sulla promozione della rigenerazione dei nervi periferici da parte delle cellule di cigno stimolate con nsPEF. Speriamo di sviluppare un nuovo modo per attivare le cellule del cigno in modo efficiente, poiché la rigenerazione nervosa è piuttosto difficile nella maggior parte dei casi. Utilizziamo in modo innovativo un nanosecondo dopo il campo elettrico nsPEF per attivare le celle del cigno.Siamo lieti di scoprire che nsPEF può essere una modalità preferita per la rigenerazione dei nervi periferici con effetti collaterali di stimolazione minimi. Inoltre, il nostro protocollo fornisce una base affidabile per successive ricerche approfondite e sistematiche. Il nostro laboratorio esplorerà continuamente l'applicazione di nsPEF.In termini di rigenerazione nervosa, costruiremo modelli animali per promuovere test in vivo e valutare la sicurezza di nsPEF in vivo. Poiché ci sono prove limitate riguardo l'applicazione di nsPEF nella rigenerazione nervosa di riferimento, speriamo di poter fare passi avanti.

regulating-schwann-cell-growth-nanosecond-pulsed-electric-field-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

411 Views.  Zhejiang University. La nostra ricerca si concentra sulla promozione della rigenerazione dei nervi periferici da parte delle cellule di cigno stimolate con nsPEF. Speriamo di sviluppare un nuovo modo per attivare le cellule del cigno in modo efficiente, poiché la rigenerazione nervosa è piuttosto difficile nella maggior parte dei casi. Utilizziamo in modo innovativo un nanosecondo dopo il campo elettrico nsPEF per attivare le celle del cigno.Siamo lieti di scoprire che nsPEF può essere una modalità pre...

Video: Autore in primo piano: Uso innovativo di nsPEF per aumentare la rigenerazione dei nervi periferici

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse Electric Field (nsPEF) is an emerging method applicable in nerve electrical stimulation that has been demonstrated to be effective in stimulating cell proliferation and other biological processes. Aiming to assess whether SCs undergo significant changes under nsPEF and help explore the potential for new peripheral nerve regeneration methods, cultured RSC96 cells were subjected to nsPEF stimulation at 5 kV and 10 kV, followed by continued cultivation for 3-4 days. Subsequently, some relevant factors expressed by SCs were assessed to demonstrate the successful stimulation, including the specific marker protein, neurotrophic factor, transcription factor, and myelination regulator. The representative results showed that nsPEF significantly enhanced the proliferation and migration of SCs and the ability to synthesize relevant factors that contribute positively to the regeneration of peripheral nerves. Simultaneously, lower expression of GFAP indicated the benign prognosis of peripheral nerve injuries. All these outcomes show that nsPEF has great potential as an efficient treatment method for peripheral nerve injuries by stimulating SCs.

Here, we present a protocol for applying nanosecond pulse electric field (nsPEF) to stimulate Schwann cells in vitro. The synthesis and secretion ability of relevant factors and cell behavior changes validated the successful stimulation using nsPEF. The study gives a positive view of the peripheral nerve regeneration method.

Ricerca

Neuroscienze

Preparing Cryopreserved RSC96 Cells for Nanosecond Pulsed Electric Field Stimulation

Preparazione di cellule RSC96 crioconservate per la stimolazione del campo elettrico pulsato a nanosecondi

Operation of the Nanosecond Pulsed Electric Field (nsPEF) Device to Stimulate Cultured RSC96 Cells

Funzionamento del dispositivo a campo elettrico pulsato a nanosecondi (nsPEF) per stimolare le cellule RSC96 in coltura

Validating the Cellular Proliferation and Migration of Nanosecond Pulsed Electric Field (nsPEF) Stimulated RSC96 Cells

Convalida della proliferazione e della migrazione cellulare delle cellule RSC96 stimolate da campo elettrico pulsato a nanosecondi (nsPEF)

Detecting the Expression of the Neurotrophic and Transcription Factors in Nanosecond Pulsed Electric Field (nsPEF) Stimulated RSC96 Cells

Rilevamento dell'espressione dei fattori neurotrofici e di trascrizione nelle cellule RSC96 stimolate con campo elettrico pulsato a nanosecondi (nsPEF)