Inizia trasfettando le cellule T HEK 293. Tre giorni dopo la trasfezione, rimuovere il terreno dai pozzetti e lavare una volta con PBS. Aggiungere 500 microlitri di tripsina in ogni pozzetto.
Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare tutte le cellule dalla piastra. Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno DMEM completo a ciascun pozzetto e risospendere le cellule. Trasferire tutte le cellule da ciascun pozzetto in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi centrifugare per due minuti a 1,000 g a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante mediante pipettaggio e lavare il pellet una volta con un millilitro di PBS. Anche in questo caso, rimuovere con cura il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS.
Trasferire le cellule in provette FACS. Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso. Caricare la sospensione cellulare non resecata.
Nel foglio di lavoro della citometria a flusso, premere Acquisisci e regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale. Per posizionare le celle nella regione centrale, eseguire il gate intorno a questa popolazione R1 per escludere i detriti nel quadrante inferiore sinistro. Cambia il gate di FL1, FL2 dot blot come G R1. Seleziona lo strumento quad gating e fai clic sull'estremità superiore destra della popolazione cellulare nel punto blot FL1/FL2 come G R1. Regolare le tensioni FL1/FL2 per posizionare le celle nel quadrante inferiore sinistro.
Premere Pausa e Interrompi. Quindi caricare le celle di controllo monocolore GFP. Premere Acquisisci e regola compensazione per posizionare le celle positive GFP nel quadrante in basso a destra.
Premere Pausa e Interrompi. Quindi, caricare le celle di controllo monocolore mCherry. Premere Acquisisci e regola compensazione per posizionare le celle positive mCherry nel quadrante in alto a sinistra.
Premere Pausa e Interrompi. Fare clic su Acquisisci nella barra dei menu e selezionare Archiviazione acquisizioni. In Criteri di raccolta, selezionare L'acquisizione si interromperà quando vengono conteggiati 10.000 eventi G1 R1.
Annullare il segno di spunta di Setup. Caricare le celle del campione. Premere Acquisisci e attendere fino a quando non sono state contate 10.000 celle G1 R1.
Ripetere lo stesso per altri campioni e controlli.
