Per iniziare, importa tutti i file fax nel dashboard di analisi. Aprire uno dei file per visualizzare il grafico a dispersione laterale in avanti. Costruisci un cancello poligonale per isolare le celle intatte, evitando detriti nell'angolo in basso a sinistra del grafico.
Etichettare la sottopopolazione come celle intatte e trascinare questo gate sulla barra di tutti i campioni. Verificare il gating per ogni campione utilizzando il pulsante del campione successivo. Fare doppio clic sulla sottopopolazione di celle intatte del campione di controllo negativo per visualizzare un nuovo grafico.
Regolare l'asse del grafico su FL1-H sull'asse X per rappresentare GFP e FL2-H sull'asse Y che rappresenta mCherry. Quindi, seleziona lo strumento quad gating e fai clic sull'estremo in alto a destra della popolazione di cellule negative. Trascina i quattro cancelli rettangolari sulla barra delle celle intatte.
Esamina ogni campione di controlli a colore singolo GFP o mCherry per verificarne il corretto gating utilizzando il pulsante del campione successivo. Passa all'editor di layout. Qui, seleziona i grafici rappresentativi e scegli Copia nell'editor di layout.
Seleziona tutti i grafici rappresentativi, quindi fai doppio clic per aprire la definizione del grafico. Assegna un nome all'etichetta dell'asse X come GFP e all'etichetta dell'asse Y come mCherry. Determinare l'efficienza relativa della riparazione del DNA confrontando il numero di cellule GFP positive con il numero di cellule mCherry positive all'interno dello stesso appezzamento.
È stata implementata un'adeguata strategia di adeguamento retributivo e di gating per garantire l'accuratezza dell'analisi NHEJ e HR. Questa strategia ha posizionato le cellule GFP positive nel quadrante inferiore destro e le celle mCherry positive nel quadrante superiore sinistro. La percentuale di cellule GFP positive indicava la riparazione del DNA DSB e l'efficienza della trasfezione.
Al contrario, la percentuale di cellule positive per mCherry rifletteva solo l'efficienza della trasfezione. L'efficienza di riparazione del DNA DSB è stata calcolata come il rapporto tra le cellule GFP positive e le cellule mCherry positive. Inoltre, il ruolo della proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e della proteina SCAR Humalog o WASH nella riparazione del DNA è stato dimostrato utilizzando il test NHEJ su cellule shCONTROL e shWASH.
La perdita di WASH ha diminuito l'efficienza di NHEJ, sottolineando il suo ruolo nella promozione di NHEJ.
