Per iniziare, scongelare il reagente enzimatico per la digestione cellulare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Sotto un microscopio a campo chiaro con ingrandimento 10x, osserva gli organoidi intestinali umani tridimensionali differenziati per garantire la salute delle cellule. Sostituire il terreno proveniente dai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente organoidi differenziati con 500 microlitri di soluzione per il recupero delle celle fredde.
Pipettare su e giù per rilasciare le cellule dalla membrana basale. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Incubare la provetta con ghiaccio per 10 minuti, pipettando su e giù ogni cinque minuti.
Centrifugare la sospensione cellulare a 400 g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante dal tubo senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 500 microlitri di reagente per la digestione delle cellule enzimatiche preriscaldato, pipettando su e giù 10 volte.
Posizionare gli organoidi per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica. Ogni 10 minuti, pipettare l'intero volume 10 volte utilizzando una pipetta P1000 per aiutare a dissociare le cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 g per tre minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione.
Pipettare rapidamente le cellule su e giù 50 volte sul ghiaccio per dissociare gli organoidi in singole cellule. Filtrare l'intero volume attraverso un colino a punta da 70 micron e raccogliere l'eluato in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Filtrare quindi l'eluato ottenuto attraverso un colino da 70 micron su un colino a punta da 40 micron.
Aggiungere cinque microlitri di Trypan Blue allo 0,4% a cinque microlitri di sospensione cellulare e contare le singole cellule vitali utilizzando l'esclusione del Trypan Blue. Diluire il campione con terreni di coltura cellulare per ottenere 1000 cellule per microlitro. Un totale di 4.402 singole cellule sono state isolate da organoidi intestinali umani tridimensionali ileali differenziati, che rappresentano i tipi di cellule attese, inclusi enterociti assorbenti e cellule secretorie.
