Per iniziare, posizionare la provetta da 15 millilitri contenente il reagente per la digestione delle cellule enzimatiche preriscaldato in un incubatore a 37 gradi Celsius fino all'uso. Aliquotare 500 microlitri di PBS/EDTA appena preparato nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Al microscopio a campo chiaro, osservare la crescita di organoidi intestinali umani tridimensionali differenziati e transwell.
Trasferire gli inserti di coltura cellulare dal terreno di coltura alla soluzione PBS/EDTA. Rimuovere il terreno di coltura dal lato apicale e sostituirlo con 100 microlitri di PBS/EDTA senza disturbare lo strato cellulare. Dopo aver scartato il PBS/EDTA, rimuovere l'inserto dal pozzetto, tamponarlo delicatamente sul bordo di un tovagliolo di carta e capovolgerlo sul piano di lavoro.
Usando una lama di bisturi affilata, taglia intorno alla circonferenza interna della membrana per rimuovere la membrana dall'inserto. Trasferire la membrana con una pinza nella provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di reagente per la digestione delle cellule enzimatiche preriscaldato. Posizionare la membrana per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica.
Ogni 10 minuti, pipettare l'intero volume cinque volte utilizzando una pipetta P 200. Trasferire da uno a due microlitri di sospensione cellulare su un vetrino ogni 10 minuti per valutare la dissociazione valutando qualitativamente la percentuale di singole cellule. Dopo la dissociazione, combinare tre pozzetti di replica per condizione in una singola provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere 400 microlitri di terreno di differenziazione per colture cellulari contenenti 10 inibitori micromolari di ROCK e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Filtrare l'intero volume attraverso un colino a punta da 70 micron, raccogliendo il flusso in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Filtrare quindi il flusso ottenuto attraverso un colino da 70 micron su un colino a punta da 40 micron.
Aggiungere cinque microlitri di blu di tripano allo 0,4% a cinque microlitri di sospensione cellulare e contare le singole cellule vitali. Diluire il campione con il terreno di coltura WRNE per ottenere 1.000 cellule per microlitro. Un totale di 5.623 singole cellule sono state isolate da organoidi intestinali umani digiunali differenziati cresciuti su inserti di coltura cellulare a membrana.
