Per iniziare, preparare il reagente enzimatico per la digestione cellulare e il PBS/EDTA per la digestione degli organoidi intestinali umani. Al microscopio a campo chiaro, confermare la crescita di organoidi intestinali umani tridimensionali differenziati come monostrati. Scartare i terreni di coltura cellulare dalla coltura monostrato e sostituirli con 100 microlitri di PBS/EDTA.
Dopo aver rimosso PBS/EDTA, aggiungere 100 microlitri di reagente caldo per la digestione delle cellule enzimatiche in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica e pipettare l'intero volume cinque volte ogni 10 minuti per 20-30 minuti. Trasferire da uno a due microlitri di sospensione cellulare su un vetrino ogni 10 minuti per valutare la dissociazione osservando la percentuale di singole cellule.
Dopo la dissociazione, combinare tre pozzetti replicati per condizione in un'unica provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 700 microlitri di terreno di differenziazione per colture cellulari contenenti 10 inibitori micromolari di ROCK e miscelare delicatamente mediante pipettaggio. Filtrare l'intero volume attraverso un colino a punta da 70 micron, raccogliendo il flusso in un tubo fresco da 1,5 millilitri.
Filtrare il flusso ottenuto attraverso un filtro da 70 micron su un filtro con punta da 40 micron. Aggiungere cinque microlitri di blu di tripano allo 0,4% a cinque microlitri di sospensione cellulare e contare le singole cellule vitali. Diluire il campione con terreni di coltura cellulare contenenti inibitore ROCK per ottenere 1.000 cellule per microlitro.
Un totale di 9.952 singole cellule sono state isolate da organoidi intestinali umani differenziati cresciuti in piastre a 96 pozzetti.
