Costruzione su larga scala di plasmidi UAS-cDNA/ORF mediante assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass)

Per eseguire le reazioni parallele in provetta in due fasi dell'assemblaggio modulare basato su CRISPR o CRISPRmass, procedere a scindere le dorsali vettoriali identiche dei plasmidi cDNA/ORF mediante sgRNA Cas9 nella prima fase di reazione in provetta. Per fare ciò, disporre i tubi da 0,2 millilitri correttamente etichettati in un blocco di raffreddamento di alluminio su ghiaccio. Preparare la miscela master per il numero N di reazioni mescolando quantità appropriate di Cas9, sgRNA, tampone Cas9 e acqua trattata con DEPC.

Una volta aggiunti i componenti della miscela master, vorticare lo stesso per garantire una corretta miscelazione. Quindi centrifugare la miscela e aliquotare due microlitri della miscela master in ciascuna provetta da 0,2 millilitri. Quindi, aggiungere 0,4 microlitri di plasmide cDNA/ORF 0,019 micromolare a ciascuna provetta.

Incubare le reazioni di scissione a 37 gradi Celsius per un'ora. Nella seguente reazione in provetta, fase due, procedere all'inserimento di un modulo UAS vettoriale specifico nei plasmidi cDNA/ORF linearizzati Cas9 risultanti. Per impostare la reazione a fase singola da 1,4 microlitri per ciascun campione, disporre le provette da 0,2 millilitri etichettate in un blocco di raffreddamento di alluminio su ghiaccio.

Preparare la miscela master per un numero N di reazioni mescolando quantità appropriate di modulo UAS e miscela master di assemblaggio di reazione a fase singola. Agitare bene il composto prima di farlo girare. Quindi aliquotare 0,77 microlitri della miscela master in ciascuna provetta.

Aggiungere 0,7 microlitri di plasmide cDNA/ORF linearizzato Cas9 all'aliquota in ciascuna provetta e incubare le reazioni a 50 gradi Celsius per un'ora.