Per iniziare, prelevare campioni di biopsia dell'esofago immersi in un terreno privo di siero di cheratinociti, o KSFM. Sostituire il KSFM con un millilitro di Dispase I e incubare le biopsie per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aspirare la Dispase senza toccare le biopsie o il pellet di detriti cellulari.
Quindi, sciacquare le biopsie con DPBS. Dopo aver centrifugato le biopsie, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aspirare il surnatante. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tripsina-EDTA alle biopsie e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti agitando a 800 giri/min.
Quindi, eseguire il pipettaggio ripetuto fino ad ottenere una sospensione a cellula singola. Utilizzando la testa dello stantuffo in gomma di una siringa di tubercolina, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri. Successivamente, lavare il colino con due o quattro millilitri di inibitore della tripsina di soia.
Quindi, filtrare le cellule attraverso un colino cellulare da 35 micrometri con un tappo a scatto su un tubo di polistirene da cinque millilitri a fondo tondo. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare nella membrana basale, estrarre la matrice di idrogel e formare goccioline da 40 microlitri in una piastra di coltura cellulare in sospensione preriscaldata.
Quindi, incubare la piastra senza terreno per 20-30 minuti a 37 gradi Celsius per garantire la solidificazione delle goccioline di estratto della membrana basale. Aggiungere KSFM preriscaldato integrato con 10 micromolari di Y27632. Il nono giorno, è stata osservata la struttura multistrato simile a una cipolla in un nucleo cheratinizzato in crescita al centro dell'organoide.
