Per iniziare, fissare un goniometro a due assi con una piastra in titanio alla piastra del tavolino per il posizionamento XY al microscopio. Attiva il software di scansione, imposta i pixel su 512 per 512 bidirezionale su acceso utilizzando un obiettivo 20X. Dopo aver eseguito l'intervento chirurgico alla finestra cranica, posizionare il cucciolo che esprime GCaMP su un lato dell'emisfero sul termoforo.
Utilizzando le viti, fissare la barra in titanio per il montaggio della testa alla piastra in titanio. Quindi regolare l'angolo della finestra orizzontalmente con il goniometro. Illumina la superficie del cervello con la retroilluminazione e seleziona l'area di imaging utilizzando il posizionamento XY con un obiettivo 5X.
Sotto una lente ad immersione in acqua 20X, somministrare un collirio alla finestra cranica. Dopo aver disabilitato la retroilluminazione, scansiona la superficie del cervello in modalità un fotone. Aumentare l'intensità del laser per visualizzare l'autofluorescenza verde dal vetro e dalla superficie del cervello.
Coprire il microscopio per evitare interferenze con la luce esterna. Avviare il software di scansione in modalità a due fotoni per l'imaging. Quindi calibrare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore per visualizzare in modo ottimale i segnali GCaMP.
Individua la profondità in un'area di imaging popolata da molti neuroni che esprimono GCaMP e avvia l'imaging time-lapse per acquisire i segnali GCaMP. La microscopia a due fotoni ha rivelato attività neuronali di quarto strato nella corteccia cilindrica di un cucciolo postnatale del sesto giorno con fluorescenza verde. Il GCaMP verde era più prominente, con conseguente perdita di segnale nel canale rosso e identificazione di 14 regioni di interesse.
