Dopo aver raccolto il tessuto adiposo intermuscolare umano omogeneizzato in un tubo a basso legame da 1,7 millilitri su ghiaccio, aggiungere 14 microlitri di Triton X-100 al 10% all'omogeneizzato. Incubare la provetta al buio su ghiaccio per 10-15 minuti mentre si agita ogni tre minuti. In una provetta conica separata da 15 millilitri, pre-bagnare un filtro cellulare da 100 e uno da 40 micron con 100 microlitri di DPBS.
Filtrare l'omogeneizzato attraverso un colino cellulare da 100 micron. Sciacquare una provetta da 1,7 millilitri a basso legame con 400 microlitri di tampone di omogeneizzazione e filtrare la sospensione fino a un colino cellulare da 100 micron. Successivamente, filtrare la sospensione ottenuta attraverso un filtrato da 100 micron su un filtro cellulare da 40 micron.
Distribuire uniformemente la soluzione in due provette pre-raffreddate da 1,7 millilitri a basso legante. Centrifugare le provette a 2700G per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare lo strato lipidico superiore e il surnatante, lasciando circa 50 microlitri nel primo tubo.
Pipettare delicatamente su e giù 20 volte senza creare bolle per risospendere il pellet nel primo tubo e trasferire la sospensione in un nuovo tubo a basso legame da 1,7 millilitri. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di isolamento dei nuclei alla provetta a basso legame da 1,7 millilitri e mescolare con il pipettaggio. Centrifugare la provetta a 1000G per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante, lasciando circa 50 microlitri nella provetta e pipettare delicatamente per risospendere il pellet. Quindi, aggiungere 200 microlitri di terreno di isolamento dei nuclei e mescolare la sospensione. Aggiungere una goccia della soluzione di colorazione delle cellule vive e incubare al buio su ghiaccio.
Dopo 15 minuti, filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 30 micron. Mescolare la soluzione di nuclei e aggiungere 10 microlitri a un vetrino della camera di conteggio cellulare. Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
