Per iniziare, isolare e incannulare i vasi linfatici mesenterici del ratto eutanasia. Pressurizzare i vasi linfatici nella camera di profusione e consentire loro di equilibrarsi e sviluppare contrazioni spontanee stabili. Quindi incubare i vasi linfatici con Fura-2-acetossimetilestere e acido pluronico per 30 minuti al buio.
Dopo l'incubazione, svuotare l'intero volume del bagno con un vuoto a pressione negativa e riempirlo nuovamente con la soluzione salina fisiologica adatta alla temperatura e priva di reagenti per tre volte. Quindi incubare i vasi linfatici al buio per altri 15 minuti per rimuovere qualsiasi indicatore in eccesso e consentire la deesterificazione. Trasferisci la camera su un microscopio a fluorescenza invertito con luce LED, obiettivo a fluorescenza 20XS, adattatore per inquadratura automatica e fotocamera per l'acquisizione a fluorescenza a 15 hertz.
Collegare il microscopio a un computer dotato di software di imaging per registrare la fluorescenza ed eseguire il rilevamento dei bordi. Attivare la sorgente luminosa a LED e l'interfaccia del sistema fluorescente. Ora avvia il software IonWizard.
Nella scheda File, seleziona l'opzione Nuovo. Quindi vai alla scheda Raccogli e seleziona Esperimento. Caricare il modello sperimentale desiderato e fare clic su OK. Fare clic sul pulsante Start situato nella parte inferiore dello schermo per avviare l'esperimento.
Quindi, regola le tracce sullo schermo per visualizzare il diametro del recipiente, il numeratore, il segnale 340, il denominatore, il segnale 380 e il rapporto in ordine decrescente. Per modificare la scala dell'asse Y per una migliore visualizzazione delle tracce, andare su Tracce, assicurarsi che l'opzione Limiti automatici sia deselezionata e selezionare Modifica limiti utente. Selezionare il parametro da regolare, inserire i valori minimo e massimo per l'asse, quindi selezionare OK per confermare.
Utilizzando il software di rilevamento dei bordi, regolare l'illuminazione in modo che la parete dei vasi linfatici appaia come linee scure. Seleziona un'area di interesse o un ROI privo di grasso e detriti e assicurati di non spostare questo ROI. Impostare la soglia in modo tale che il bordo della parete del serbatoio venga rilevato durante l'intero ciclo di contrazione.
Dopo aver attivato il tubo fotomoltiplicatore, utilizzando gli illuminatori a LED alternare lunghezze d'onda di 340 e 380 nanometri ed esposizioni di 50 millisecondi per eccitare Fura-2. Cattura gli spettri di emissione a 510 nanometri e 15 hertz sull'intero campo di imaging. Per misurare il rapporto segnale/fondo, ottenere prima la fluorescenza 340 e 380 con il vaso linfatico al centro del campo visivo.
Quindi sposta il campo visivo sul bordo della vasca senza recipienti per catturare lo sfondo. Successivamente, sostituire la soluzione del bagno con una soluzione salina fisiologica priva di reagenti in corrispondenza della temperatura per rimuovere l'indicatore Fura-2 in eccesso. Registrare il segnale fluorescente Fura-2 al basale e le contrazioni spontanee per circa 30 minuti.
Quindi registrare la risposta cumulativa alla concentrazione di Nifedipina e ottenere misurazioni di base per ciascuna concentrazione di farmaco. Alla fine di ogni esperimento, lavare i vasi linfatici con una soluzione salina fisiologica priva di calcio in corrispondenza della temperatura per ottenere il segnale fluorescente Fura-2 minimo e il diametro massimo dei vasi linfatici in assenza di ioni calcio. Scambiare la soluzione del bagno con una soluzione salina fisiologica a temperatura corrispondente contenente 10 millimolari di ioni calcio e ionomicina per ottenere il massimo segnale fluorescente Fura-2 e il diametro minimo dei vasi linfatici in condizioni di saturazione degli ioni calcio.
I parametri, tra cui l'ampiezza del picco di calcio, il calcio basale e il picco di calcio, hanno mostrato una riduzione dipendente dalla concentrazione con l'aggiunta incrementale di nifedipina alla camera di perfusione. Allo stesso tempo, anche i parametri contrattili, come la contrazione, l'ampiezza e il flusso calcolato, hanno dimostrato una diminuzione graduale. I grafici di Manhattan hanno mostrato le risposte dei singoli vasi linfatici per le misure di ritmicità, tra cui intervallo, tempo di contrazione e tempo di rilassamento.
