Dopo aver raccolto fasci di gameti da ermafroditi e spermatozoi da specie di coralli gonocori, metterli in provette da 50 millilitri etichettate. Posizionare quattro microlitri di sospensione di spermatozoi attivati su una camera di conteggio Makler. Per valutare la motilità degli spermatozoi, aggiungere la concentrazione del campione attivato.
Apri il file della scheda tecnica automatica del corallo biobanking e inserisci il fattore di diluizione dello sperma utilizzato per la valutazione dell'analisi dello sperma assistita da computer. Quindi, inserisci i risultati dell'analisi dello sperma assistita da computer per la concentrazione degli spermatozoi, la motilità totale e la motilità progressiva. Annotare la concentrazione di spermatozoi sulla provetta del campione di sperma filtrato e trasferire la provetta alla postazione di crioconservazione.
Apri la scheda tecnica automatica della biobanca dei coralli condivisa e seleziona la scheda Crioconservazione. Dopo aver controllato l'etichetta della provetta del campione di sperma, identificare la voce corrispondente controllando l'ID della colonia. Utilizzando una pipetta sierologica, misurare il volume del campione di sperma prelevandolo ed espellendolo nuovamente nella stessa provetta. Immettere il valore nella colonna E.Controllare la colonna 1 calcolata automaticamente per la concentrazione di crioprotettore richiesta e la colonna H per il volume di criodiluente da aggiungere.
Avvia un timer. E usando una pipetta, aggiungere goccia a goccia il DMSO criodiluente mescolando costantemente e delicatamente il campione. Registrare l'ora dell'edizione criodiluente nella colonna P.Leggere la colonna K per determinare il numero di fiale criogeniche da riempire.
Aprire le fiale criogeniche sterili con codice a barre e disporre i tappi su una superficie sterile. Utilizzando una pipetta sierologica e un pipettatore aliquotatore, aliquotare un millilitro di campioni in fiale criogeniche con codice a barre e richiudere. Posizionare una fiala di termocoppia e tutte le fiale di campioni riempite in un inserto criogenico vuoto a temperatura ambiente.
Quindi, posizionare le fiale criogeniche fittizie contenenti il 10% di DMSO in acqua di mare filtrata nelle fessure vuote della griglia criogenica. Inserire il numero di corsa nella colonna U della scheda tecnica automatica e scansionare il numero di serie del rack criogenico nella colonna V.Posizionare il cursore nella cella corretta della colonna Z e scansionare la fiala della termocoppia, seguita da tutte le provette della fiala criogenica. Mettere da parte i rack caricati e scansionati per il resto dell'equilibrio crioprotettivo.
Riempire il recipiente di raffreddamento della criogriglia con azoto liquido fino al livello necessario per il raffreddamento a circa 20 gradi Celsius al minuto. Dopo il periodo di equilibratura crioprotettore di 10 minuti, collegare la sonda della termocoppia al registratore di dati e avviare la registrazione. Posizionare delicatamente la griglia criogenica completa nel recipiente di raffreddamento e applicare il coperchio.
Registrare l'ora di inizio nella colonna Q.Una volta che la fiala della termocoppia indica 80 gradi Celsius o inferiori sul registratore di dati, trasferire l'inserto del rack criogenico in un bagno di azoto liquido per spegnere i campioni. Rimuovere le fiale criogeniche dal rack e trasferirle in un contenitore a secco per il trasporto alla biobanca. Nell'Acropora millepora, i vetrini della camera di scorrimento della copertura fissa hanno mostrato meno della metà dei conteggi delle concentrazioni di spermatozoi rispetto alla camera di conteggio di Makler.
La convalida della camera di conteggio Makler con microsfere di lattice disponibili in commercio a una concentrazione nota ha portato a conteggi coerenti con bassa variabilità all'interno dell'intervallo previsto. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle concentrazioni post-disgelo di spermatozoi totali, mobili o progressivamente mobili nei campioni crioconservati utilizzando il 20% o il 30% di DMSO come criodiluente.
