Inizia sezionando l'ippocampo da un cervello di topo embrionale e posiziona il tessuto sezionato in un tampone ghiacciato privo di calcio e magnesio o CMF. Quindi, rimuovere il CMF e risciacquare il fazzoletto quattro volte con CMF freddo fresco, facendo roteare delicatamente il tubo tra un risciacquo e l'altro. Quindi aggiungere la soluzione filtrata di tripsina allo 0,125% e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius, agitando ogni cinque minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di tripsina e lavare due volte con CMF ghiacciato. Quindi aggiungere tre millilitri di soluzione di inattivazione della tripsina. Successivamente, per dissociare le cellule, titolare 30 volte utilizzando due secondi prelievi con un ago calibro 14 collegato a una siringa da tre millilitri.
Continuare la titolazione con due secondi di aspirazione 30 volte con un ago calibro 15, quindi 20 volte con un ago calibro 16, seguite da 20 volte con un ago calibro 18. Quindi eseguire tre secondi di prelievo utilizzando un ago calibro 21 15 volte per completare la dissociazione cellulare. Verificare la presenza di grumi cellulari posizionando una gocciolina della sospensione cellulare su un vetrino da microscopio.
Quindi, filtrare cinque millilitri di FBS utilizzando un filtro per siringa da 0,22 micron. Stratificare delicatamente la sospensione cellulare sull'FBS in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 200 x g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere FBS e risospendere il pellet in un millilitro di terreno neurobasale caldo privo di antibiotici antibiotici. Diluire la sospensione cellulare in blu di tripano allo 0,4% e ottenere una conta cellulare. Piastra le cellule in 750 microlitri di terreno neurobasale privo di antibiotici in un vetrino a camera a 4 pozzetti rivestito di poli-D-lisina preriscaldato.
Incubare le cellule in una camera a umidità controllata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.
