Metodo a gradiente continuo per la purificazione delle isole suine

Per iniziare, impostare una pompa su una portata di 200 millilitri al minuto e caricare 125 millilitri di soluzione a gradiente ad alta densità nel formatore a gradiente continuo e quindi nel processore di celle. Avviare la funzione centrifuga del processore di celle a 1.000 giri/min. Rilasciare l'aria dal sistema e ripeterla con una soluzione a gradiente ad alta densità.

Quindi aggiungere 125 millilitri di soluzione a gradiente ad alta densità e 130 millilitri di soluzione a bassa densità al formatore a gradiente. Caricare 100 millilitri di sospensione tissutale digerita. Aumentare la velocità del processore della cella a 2.000 giri/min per tre minuti.

Per preparare 16 provette coniche da 50 millilitri per la raccolta della frazione di isole purificate, aggiungere 25 millilitri di terreno RPMI a ciascuna provetta e disporle in ordine crescente. Raccogliere le frazioni di isole purificate nelle provette coniche preparate. Per colorare le isole, raccogliere da 100 a 200 microlitri di aliquote da ciascuna frazione di isole purificata e valutare il contenuto delle isole utilizzando la colorazione DTZ in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.

Ispeziona ogni frazione usando la microscopia ottica a 4X, dove le isole appariranno dal rosso scuro al nero. Utilizzando questo protocollo, l'isolamento delle isole pancreatiche è stato eseguito su tre suini. Le immagini in campo chiaro hanno mostrato isole pancreatiche purificate, che sono state caratterizzate per la vitalità utilizzando la colorazione viva/morta.

La distribuzione rappresentativa delle dimensioni delle isole dopo l'isolamento delle isole ha mostrato una distribuzione dimensionale compresa tra 50 e 100 micron. Inoltre, la resa e la purezza sono state valutate utilizzando un contatore di cellule insulari, indicando isolamenti pancreatici suini efficienti.