Per iniziare, recupera due provette di crioconservazione contenenti cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana congelate al passaggio tre dall'azoto liquido. Agitarli a bagnomaria a 37 gradi Celsius fino a quando non saranno completamente scongelati. Quindi disinfettare i tubi con alcol al 75%.
Posiziona i tubi disinfettati su un tavolo ultra-pulito. Utilizzando una pipetta, aspirare la sospensione cellulare e trasferirla in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare la provetta in una centrifuga a bassa velocità a 250 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Nel frattempo, prepara quattro piatti di coltura da 10 centimetri e aggiungi nove millilitri di terreno a ciascun piatto. Segna il nome, il tipo di cella, la generazione e la data dell'esperimento su ogni piatto. Quindi preriscaldarli in un incubatore di celle termostatiche a 37 gradi Celsius.
Una volta terminata la centrifugazione di cinque minuti, disinfettare la provetta da centrifuga prima di spostarla su un tavolo ultra-pulito. Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante e aggiungere quattro millilitri di terreno per ottenere la concentrazione cellulare desiderata. Agitare delicatamente la soluzione fino a quando non si disperde uniformemente.
Quindi, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a ciascun piatto preriscaldato e agitarlo agitando lo stesso su una superficie piana a croce. Osservare le cellule con un ingrandimento di 40x al microscopio ottico prima di posizionare le piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno, osservare lo stato della cellula al microscopio ottico con un ingrandimento di 40x prima di procedere con la preparazione del mezzo di scambio.
Dopo la disinfezione, trasferire le piastre di coltura su un tavolo ultra-pulito con livello di biosicurezza 2. Rimuovere il terreno da ogni piatto di coltura. Sciacquare delicatamente il piatto con due millilitri di soluzione PBS due volte e aggiungere 10 millilitri di terreno a ciascun piatto.
Trasferire le cellule nell'incubatore fino a quando non sono pronte per la raccolta del surnatante.
