Per iniziare, raccogli il surnatante dalla coltura di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana una volta che le cellule sono confluenti all'80%. Raccogliere con cura il surnatante utilizzando una pipetta e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le cellule sospese, quindi utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante senza disturbare il pellet.
Centrifugare il surnatante a 2000 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante risultante con una pipetta e filtrarlo attraverso una membrana da 0,22 micron per rimuovere le particelle di grandi dimensioni e i detriti cellulari. Sottoporre il filtrato a ultracentrifugazione a 10.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi eseguire una centrifugazione finale a 100.000 x g per 70 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante senza raccogliere il pellet. Risospendere il pellet in PBS prima di centrifugare la provetta a 100.000 x g per 70 minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ottenuto di vescicole extracellulari, o EVs, in un millilitro di PBS. Infine, trasferisci la sospensione EV in una provetta da centrifuga da un millilitro e conservala a quattro gradi Celsius fino a ulteriori analisi. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato chiaramente la struttura a forma di coppa delle vescicole extracellulari con una membrana a doppio strato.
L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha indicato che hanno una distribuzione granulometrica di circa 50-150 nanometri. L'analisi del western blot ha mostrato che le proteine marcatrici caratteristiche delle vescicole extracellulari erano espresse in modo uniforme.
