Colorazione viva/morta di cellule muscolari scheletriche, isolate da topi danneggiati da Notexin, con fissazione di cisplatino e paraformaldeide

Per iniziare, risospendere le cellule muscolari scheletriche isolate da topi danneggiati da Notexin marcati con iododesossiuridina in un millilitro di DMEM libero dal siero freddo e contarle utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule. Sotto una cappa aspirante, aggiungere il brodo di cisplatino per ottenere una concentrazione finale di 25 micromolari. Agitare la provetta per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per un minuto.

Spegnere la reazione con DMEM ghiacciato contenente il 10% di FBS e posizionarlo sul ghiaccio. Dopo la pellettatura e la risospensione delle cellule, filtrare la sospensione attraverso un colino a celle da 35 micrometri. Sotto una cappa aspirante, aggiungere la soluzione madre di paraformaldeide filtrata per fissare la sospensione cellulare e il vortice per 30 secondi.

Lavarlo due volte con due millilitri di terreno di colorazione cellulare o CSM per centrifugazione. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante a circa 60 microlitri e risospendere accuratamente il pellet. Aggiungere 40 microlitri di miscela colorante per anticorpi superficiali 2,5 volte preparata in CSM e incubare per un'ora agitandoli ogni 20 minuti.

Dopo aver lavato il campione due volte con CSM, aspirare il surnatante e azionare il pellet. Per permeabilizzare le celle, sotto una cappa aspirante, aggiungere 0,5 millilitri di metanolo ghiacciato goccia a goccia durante il vortex. Lavare le celle due volte con un millilitro di CSM per centrifugazione.

Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il surnatante a circa 60 microlitri e risospendere accuratamente il pellet. Incubare le cellule con 40 microlitri di miscela di colorazione anticorpale intracellulare per un'ora, agitando i campioni ogni 20 minuti. Dopo aver lavato le celle due volte con un millilitro di CSM, risospendere i campioni in 0,5 millilitri della soluzione di iridio intercalatore e vortex.