Per iniziare, pulire accuratamente tutte le aree dell'incubatrice e della pompa peristaltica con un disinfettante per garantire un ambiente quasi sterile. Quindi lavare ogni tubo con 700 microlitri di PBS con magnesio e calcio, seguiti da 500 microlitri di terreno condizionato con C2 o EC. Utilizzare il tubo con la breve distanza dal blocco dell'esca al tappo della pompa peristaltica per la cavità sinistra e il tubo con l'altra simmetria per la cavità destra.
Dopo aver prelevato il biochip con cellule HUVEC e C2BBe1 dall'incubatore, eseguire uno scambio di terreno con 350 microlitri per ogni camera. Quindi spostare i tappi dal sito inferiore a quello superiore. Aggiungere 350 microlitri di terreno fresco nella camera inferiore del biochip.
Successivamente, rimuovi tutte le spine e riempi tutte le porte fino in cima. Partendo dalla cavità sinistra, inserire l'adattatore di blocco dell'esca nella porta del biochip per collegare il primo tubo alla porta destra della camera superiore. Quindi collegare il secondo tubo alla porta sinistra della camera inferiore.
Quindi, prendi un serbatoio e aggiungi una piccola goccia di terreno di coltura cellulare sul fondo del serbatoio. Quindi inserire il serbatoio sul lato opposto del primo tubo e ripetere per l'altra camera. Una volta che tutte le porte sono collegate a un tubo o a un serbatoio, riempire i serbatoi con 3,5 millilitri di terreno di coltura cellulare.
Quindi posizionare il lato libero del tubo, a cui è attaccato il coperchio, sulla parte superiore del serbatoio per chiudere il sistema microfluidico di ciascuna camera. Trasportare il biochip alla pompa peristaltica. Utilizzando i tappi peristaltici della pompa, collegare ciascun tubo alla pompa peristaltica in modo che il fluido fluisca dal serbatoio nella cavità e torni indietro attraverso la pompa.
Quindi perfondere ogni camera con una portata di 50 microlitri al minuto. Una volta completata la preprofusione, arrestare la pompa peristaltica. Rimuovere il coperchio collegato al tubo di ciascun serbatoio e posizionarlo su un fazzoletto sterile accanto alla pompa.
Dopo aver rimosso tutto il terreno, riempire i serbatoi con 2 millilitri di terreno appena preparato. Ricollegare il tubo e il coperchio e continuare la perfusione circolare a una portata di 50 microlitri al minuto per altre 24 ore. Una volta arrestata la pompa peristaltica, aprire i serbatoi di tutte le cavità.
Svuotare i serbatoi e scollegare i tubi e i serbatoi dal biochip. Lavare le cavità microfluidiche con 500 microlitri di PBS freddo con magnesio e calcio due volte per camera. Aggiungere 500 microlitri di metanolo ghiacciato a tutte le cavità.
Dopo aver aperto il chip, tagliare o rimuovere la pellicola adesiva del biochip. Tagliare a metà il tessuto contenente la membrana in PET per colorarlo in parallelo con diversi pannelli immunologici. Utilizzando una pinzetta di precisione, trasferire ogni pezzo di membrana in un pozzetto separato in una piastra a 24 pozzetti con una soluzione bloccante e permeabilizzante.
Quindi trasferire i pezzi della membrana su un vetrino pulito all'interno di una camera umida. Aggiungere 50 microlitri di anticorpo primario preparato e soluzione colorante a ciascun pezzo di membrana. Una volta che i campioni sono stati trasferiti in una piastra a 24 pozzetti, lavare le membrane due volte per 5 minuti con soluzione di lavaggio, quindi con PBS contenente magnesio e calcio.
Utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza e un vetro di copertura, montare i pezzi della membrana su un vetrino di vetro pulito e conservarli a 4 gradi Celsius fino all'imaging microscopico. Dopo cinque giorni di profusione, il DNA nucleare colorato con DAPI ha mostrato macrofagi derivati da monociti completamente differenziati che esprimono CD68 diffondendosi in tutto il tessuto vascolare. Gli HUVEC hanno creato uno strato confluente che mostra l'integrità dei tessuti attraverso la formazione di giunzioni di aderenza, come la VE-caderina.
Inoltre, il fattore di von Willebrand è altamente espresso dagli HUVEC. Dopo cinque giorni di profusione, le cellule C2BBe1 hanno formato strati di cellule epiteliali polarizzate che esprimono le proteine della giunzione E-caderina e ZO-1. La crescita tridimensionale di strutture simili a villi e cripte dell'epitelio può essere rilevata nelle sezioni x e y della pila Z dopo sei giorni di perfusione.
