Per iniziare, risospendere i macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale di topo in DMEM completo senza rosso fenolo o antibiotici. Semina 500 microlitri di sospensione cellulare a una densità di 200.000 per quadrante in un piatto quadruplo da 35 millimetri. Rimuovi lo stock precalcolato di Escherichia coli da meno 80 gradi Celsius.
Aliquotare il volume desiderato di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri per preparare l'inoculo batterico a una molteplicità di infezione di 25, quindi aggiungere PBS a un volume totale di un millilitro. Centrifugare la sospensione batterica a 2000 G per cinque minuti e risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS. Aggiungere il colorante fluorescente verde sensibile al pH a una concentrazione finale di 500 micro molari e incubare per 20 minuti al buio per la coniugazione del colorante.
Lavare i batteri quattro volte con un millilitro di PBS mediante centrifugazione a 1000 G per cinque minuti. Risospendere il pellet in 500 microlitri di DMEM completo senza rosso fenolo e aggiungere le colture di macrofagi derivate dal midollo osseo. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per quattro ore.
Aggiungere 200 nanogrammi di colorante fluorescente rosso permeabile alle cellule per colorare i lisosomi, Dopo l'infezione batterica, sono stati rilevati abbondanti batteri fluorescenti verdi fagocitati all'interno dei macrofagi derivati dal midollo osseo. La fluorescenza verde si localizza ulteriormente con una fluorescenza rossa indicativa di lisosomi acidificati. Durante le quattro ore di infezione sono state osservate anche la fagocitosi e la comparsa di macrofagi di derivazione del midollo osseo neonatale dipositivi sensibili al pH verde.
