Per osservare la localizzazione subcellulare della GFP, dopo 48 ore di agroinfiltrazione di Nicotiana benthamiana, selezionare una foglia piatta e praticare un foro di sei millimetri utilizzando un perforatore. Versare la soluzione di saccarosio al 30% su un vetrino. Posizionare il campione di foglie con la parte posteriore rivolta verso l'alto e coprirlo con un vetro di copertura.
Raccogliere le foglie intatte e fresche di N. benthamiana che esprimono GFP ricombinante tre giorni dopo l'agroinfiltrazione e pesare le foglie. Sciacquare la lamina fogliare con acqua pre-raffreddata, sterilizzata e bidistillata per rimuovere i detriti. Immergere 20 grammi con il lato abassiale rivolto verso il basso in 500 millilitri di tampone fosfato pre-raffreddato da 100 millimolari in un becher a bocca larga da 1.000 millilitri.
Copri le foglie con nylon 100 mesh, filato a maglie fini e un piatto di plastica. Collegare il becher a una pompa per vuoto. Applicare il vuoto a 0,8 megapascal per un minuto, quindi ripristinare rapidamente la pressione atmosferica.
Rimuovere le foglie dal tampone e asciugare delicatamente con carta assorbente. Arrotolare le foglie e avvolgerle con il filo a rete. Per la raccolta del liquido di lavaggio apoplastico, o AWF, posizionare le foglie arrotolate con la punta rivolta verso l'alto in provette da centrifuga da 50 millilitri con filo a rete fissato dai tappi delle provette.
Centrifugare le foglie a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere le foglie e raccogliere l'AWF utilizzando una pipetta. Aggiungere la resina di nichel sefarosio excel a un tubo in un rapporto di uno a 1.000 rispetto al volume dell'estratto proteico.
Lavare separatamente la resina di nichel tre volte con 10 volte il volume di resina dell'acqua a doppia distillazione e del tampone fosfato. Incubare l'estratto proteico con resina di nichel per due ore per consentire il legame completo. Quindi, centrifugare a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere le proteine non legate nel surnatante.
Lavare tre volte con 20 volte il volume di resina del tampone fosfato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 volte il volume di resina di 250 millimolari di imidazolo per eluire le GFP. Centrifugare la miscela a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante.
L'analisi Western blot ha confermato l'espressione transitoria di 30 glicole ricombinanti della proteina ricombinante kilodalton in N.benthamiana. La microscopia a fluorescenza ha illustrato la presenza di GFP all'interno dell'apoplasto. Anche le proteine AWF estratte mediante centrifugazione per infiltrazione sotto vuoto contenevano GFP.
Delle otto soluzioni di estrazione testate, il tampone fosfato ha estratto la maggior quantità di AWF e GFP. Il confronto del tampone fosfato a pH variabile ha rivelato una migliore estrazione di AWF e GFP in condizioni da neutre a leggermente alcaline. Inoltre, il tampone fosfato 100 millimolare ha mostrato la massima efficacia per il recupero di AWF e GFP.
Con un tampone fosfato da 100 millimolari, sono stati recuperati dall'apoplasto 495 microgrammi di proteine AWF totali per grammo di foglia fresca. L'AWF estratto conteneva 10 microgrammi di GFP, che corrispondevano a circa il 18% delle GFP nella proteina solubile totale. A seguito della cromatografia di affinità con nichel, la purezza delle GFP ha raggiunto l'84,3% dall'estrazione dell'AWF, sostanzialmente superiore alla purezza del 44,9% ottenuta attraverso l'estrazione di proteine solubili totali.
