Per iniziare la coltura da cinque volte 10 a 5 cellule DF-1 per pozzetto in una piastra a sei pozzetti con DMEM integrato con il 10% di FBS. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, scartare il siero contenente il terreno di coltura cellulare. Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, aggiungere due millilitri di terreno di coltura cellulare privo di siero, seguiti da una soluzione virale IBDV in ciascun pozzetto.
Dopo un'ora di assorbimento del virus, lavare le cellule con PBS tre volte e incubarle per 24 ore con due millilitri di DMEM integrato con il 2% di FBS. Aggiungere 500 microlitri di tripsina per pozzetto, seguiti da due millilitri di DMEM con il 10% di FBS dopo un minuto. Centrifugare le cellule e rimuovere con cura il surnatante.
Dopo aver risospeso il pellet di cella in PBS, agitare delicatamente la provetta per tre secondi e centrifugare le celle come descritto in precedenza. Utilizzando un emocitometro al microscopio, contare le cellule per risospenderle in un volume appropriato di tampone di colorazione per citometria a flusso e agitare la sospensione. Aggiungere 100 microlitri della sospensione a cella singola in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri.
Incubare le cellule infette da IBDV e simulare le cellule di controllo con un microgrammo di anticorpo appropriato su ghiaccio per 30 minuti al buio. Agitare delicatamente il tubo ogni 10 minuti. Lavare le cellule con un millilitro di tampone di colorazione per citometria a flusso e centrifugare la provetta.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone di colorazione per citometria a flusso. Quindi incubare le cellule con 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. E aggiungere 400 microlitri di tampone di colorazione per citometria a flusso per il test di citometria a flusso.
Eseguire la citometria a flusso con la provetta di controllo vuota seguita dalle singole provette colorate per regolare la tensione e i parametri di compensazione prima di eseguire tutti i campioni. La citometria a flusso ha indicato che un numero considerevole di cellule era positivo per i frammenti N-terminali di Gasdermin E di pollo dopo l'infezione da IBV, mentre i frammenti C-terminali di Gasdermin E di pollo scisso erano appena rilevabili dalla citometria a flusso utilizzando la colorazione dell'antigene sulla superficie della membrana. La popolazione di frammenti N-terminali di cellule doppiamente positive di Gasdermin E di pollo e ioduro di propidio nelle cellule infette da IBDV era significativamente maggiore di quella dei controlli infetti simulati, suggerendo che questa parte delle cellule infettate da IBDV era in fase di piroptosi.
