Inizia rivestendo la matrice extracellulare su inserti di coltura cellulare per colture monostrato 2D derivate da organoidi. Applicare 100 microlitri di rivestimento della matrice extracellulare sulla camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare preparato e riposizionare il coperchio. Quindi incubare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora.
Per le cellule organoidi rettali, dopo l'incubazione, sostituire il rivestimento della matrice extracellulare con un terreno di coltura rettale monostrato e incubare durante la notte. Dopo la digestione enzimatica degli organoidi e la filtrazione in singole cellule, centrifugare la sospensione cellulare a 200 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e quindi scartare il surnatante. Quindi, preparare 200 microlitri di sospensioni cellulari per inserto di coltura cellulare in terreni di coltura monostrato.
Recuperare la piastra per colture cellulari a 24 pozzetti contenente inserti per colture cellulari rivestiti di matrice extracellulare. Utilizzando l'aspirazione sottovuoto, svuotare accuratamente la camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare per evitare di interrompere il rivestimento. Applicare con cura 200 microlitri di sospensione monocellulare nella camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare.
Aggiungere 500 microlitri del terreno di coltura monostrato opportunamente integrato nella camera basolaterale di ciascun pozzetto. Quindi incubare la piastra in un incubatore umidificato per promuovere l'adesione e la crescita cellulare, formando un monostrato 2D confluente sull'inserto della coltura cellulare. Cambiare i terreni di coltura sia nella camera apicale che in quella basolaterale a giorni alterni, a partire da 48 ore dopo la semina cellulare.
Per la colorazione immunofluorescente di monostrato 2D derivato da organoidi, ritagliare con cura la membrana dell'inserto per colture cellulari con una lama di bisturi e posizionare l'inserto per colture cellulari su un vetrino. Aggiungere il supporto di montaggio su un vetrino coprioggetti e posizionarlo sul vetrino prima di osservare le celle. Un giorno dopo la semina di organoidi maturi dissociati su un inserto di coltura cellulare, è apparso che si formava un monostrato 2D.
La microscopia elettronica a scansione ha rivelato microvilli ben sviluppati e demarcazione cellulare sulla superficie apicale dei monostrati 2D cinque giorni dopo la semina. La colorazione immunofluorescente dei monostrati 2D ha confermato la presenza di bordo apicale a spazzola, giunzioni di aderenza basolaterali e cellule caliciformi produttrici di muco nei monostrati 2D derivati da organoidi ileali e rettali.
