Inizia dissociando il tessuto. Utilizzare due paia di pinze per rimuovere il tessuto adiposo dal tessuto mammario. Assicurarsi che il tessuto mammario rimanente pesi circa un grammo.
Sciacquare il tessuto mammario in cinque millilitri di soluzione di etanolo al 75% per cinque secondi. Quindi, lavare con 20 millilitri di soluzione di lavaggio due volte per cinque minuti ciascuna. Quindi, utilizzare due lame chirurgiche per tagliare il tessuto mammario in frammenti più piccoli.
Continuamente per 15 minuti per ottenere un omogeneizzato di tessuto, trasferire il tessuto triturato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di soluzione di dispasi e collagenasi, tre millilitri di tripsina allo 0,25% e sette millilitri di PBS per un totale di 20 millilitri di soluzione digestiva. Mettere la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per 1 ora e mezza, agitando la provetta ogni 20 minuti.
Per fermare il processo di digestione, aggiungere 20 millilitri di soluzione neutralizzante. Quindi, pipettare il contenuto circa 15 volte per garantire una miscelazione accurata. Filtrare la miscela attraverso un filtro a maglie da 100 micron.
Dopodiché, centrifugare a 156 G per cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante. Ripetere l'incubazione del pellet con 20 millilitri di soluzione neutralizzante, quindi miscelare mediante pipettaggio.
Centrifugare nuovamente per cinque minuti. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di terreno di coltura iniziale. Piastra la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare da 100 millimetri.
Coltiva le cellule in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Sostituire il terreno di coltura originale con un terreno di coltura epiteliale fresco ogni tre giorni. Controllare le celle e rinfrescare il terreno ogni due giorni.
Utilizzando questo protocollo, le cellule epiteliali mammarie umane sono state isolate dal tessuto mammario. L'analisi post-isolamento ha mostrato che le cellule trattate con l'inibitore ROCK Y-27632 mostravano una crescita pronunciata rispetto al gruppo di controllo. Il test CCK-8 ha rivelato che le cellule nel terreno contenente Y-27632 proliferavano a un tasso significativamente più elevato rispetto a quelle nel terreno di controllo.
I saggi di immunofluorescenza hanno confermato che la maggior parte delle cellule esprimeva marcatori di cellule epiteliali mammarie, CK7 e GATA3, con una presenza trascurabile di altri tipi di cellule nei passaggi successivi. Inoltre, gli studi di qRT-PCR hanno mostrato livelli di espressione costanti di CK7 e GATA3 in diversi passaggi, indicando un fenotipo coerente o una capacità di differenziazione.
