Per iniziare, utilizzare una spatola pre-raffreddata per aggiungere 100 milligrammi di polvere di tessuto vegetale in una provetta per microcentrifuga in polipropilene a più livelli. Quindi aggiungere immediatamente un millilitro di metanolo al 20% al tubo. Posizionare il tubo tappato su uno shaker a dondolo per tre ore a temperatura ambiente.
Quindi, centrifugare la provetta a 9.464 G per 10 minuti e raccogliere il surnatante in una fiala di autocampionatore LC-MS. Impostazione di uno strumento LC-MS con una sorgente di ionizzazione elettrospray e una colonna HPLC in fase inversa. Per l'HPLC, utilizzare lo 0,1% di acido formico in acqua come solvente A e lo 0,1% di acido formico in acetonitrile come solvente B.Regolare la temperatura del forno a colonna a 45 gradi Celsius e la portata a 0,5 millilitri al minuto.
Equilibrare la colonna con 99%A e 1%B. Impostare un gradiente di 30 minuti per aumentare la concentrazione del solvente B dall'1% al 50% in 26 minuti, quindi tornare rapidamente all'1%B a 26,01 minuti e mantenere premuto per quattro minuti. Configurare i parametri operativi dello spettrometro di massa.
Impostare la tensione di interfaccia a quattro kilovolt, il flusso di gas di nebulizzazione a tre litri al minuto e il flusso di gas di riscaldamento a 10 litri al minuto. Regolare la temperatura della linea di desolvatazione a 250 gradi Celsius, la temperatura del blocco termico a 400 gradi Celsius e la temperatura dell'interfaccia a 300 gradi Celsius. Impostare il flusso di gas di essiccazione a 10 litri al minuto e la pressione del gas di dissociazione indotta da collisione a 17 kilopascal.
Costruire un metodo MS in modalità positiva della sorgente di ionizzazione elettrospray, includere scansioni Q3 e Q1 che coprono l'intervallo di massa da 100 a 1.000 dalton con la scansione Q1 che funge da evento di indagine con esclusione automatica degli isotopi. Aggiungi un collegamento alla scansione ionica del prodotto alla scansione Q1 con una finestra di massa da 50 a 1.000 dalton, un'energia della cella di collisione di meno 20 volt e un tempo dell'evento inferiore a 0,2 secondi. Successivamente, regolare il metodo MS per aggiungere scansioni ioniche precursori in modalità positiva uguali alla lunghezza del metodo LC con energie della cella di collisione di meno 20 volt e tempi di evento di 0,75 secondi.
Assicurarsi che in tutti i casi siano abilitate le funzioni di esclusione automatica degli isotopi o di deisotoping. Impostare i valori di carica master per frammenti di alcaloidi tropanici monosostituiti, disostituiti e trisostituiti. Successivamente, al metodo MS-MS, aggiungere scansioni di perdita neutra in modalità positiva pari alla lunghezza del metodo LC con energie della cella di collisione di meno 20 volt e tempi di evento di 0,75 secondi.
Assicurarsi che in tutti i casi siano abilitate le funzioni di esclusione isotopica automatica o di deisotoping. Impostare le masse neutre di perdita di interesse per gli esteri sugli alcaloidi tropanici per gli esteri derivati dall'acido tiglico, dai gruppi acetilici e dagli esteri degli acidi fenillattici o tropici. Scarica il metodo LC-MS e crea i file di dati per i campioni di interesse.
Una volta che la colonna HPLC è stata bilanciata a 45 gradi Celsius, iniettare da 10 a 20 microlitri di campione.
