Per iniziare, procurati embrioni di zebrafish anestetizzati nel tampone E3. Dopo aver selezionato gli embrioni con la fluorescenza desiderata, visualizza il loro battito cardiaco sotto uno stereomicroscopio a campo chiaro. Utilizzando una pipetta di trasferimento con punta larga, prelevare fino a tre embrioni e trasferirli su una piastra ai fosfori in vetro inferiore.
Sotto uno stereomicroscopio, utilizzando una pipetta, sostituire il terreno intorno agli embrioni con una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1%. Utilizzando una punta affusolata sottile di plastica attaccata a un ago per stuzzicare, spingere delicatamente ogni embrione verso il fondo della piastra ai fosfori e orientare il lato dorsale verso il vetro. Montare l'embrione in un microscopio confocale invertito.
Dopo aver impostato i parametri di acquisizione time-lapse, acquisire le immagini. Apri il software di conversione file Imaris e trascina e rilascia i file nell'area di input. Nel menu Output, specificare la posizione per i file convertiti.
Fare clic sulla dimensione del voxel impostata per verificare e premere il pulsante Avvia tutto per avviare la conversione del file in formato IMS. Una volta avviato, lascia che il software di analisi inizi nell'arena. Fare clic su Osserva cartella per aprire il file precedentemente convertito.
Una volta caricato il file nel software, fare clic sulla vista Slice per scorrere lo z-stack. Utilizzando il cursore nella barra degli strumenti Sezione, misurare i diametri delle celle dopo aver disegnato il diametro delle celle selezionate con il puntatore. Fare clic e trascinare il mouse per disegnare i segmenti che attraversano il nucleo della cella e osservare la lunghezza del segmento disegnato nella barra degli strumenti di misurazione situata a destra dell'area di visualizzazione.
Per rilevare automaticamente le celle, tornare alla vista 3D e fare clic sull'icona Spot nella barra degli strumenti dell'oggetto per aggiungere un nuovo oggetto Spot nell'elenco degli oggetti e aprire la procedura guidata di creazione automatica delle macchie. Nel primo passaggio della procedura guidata, scegli l'opzione per segmentare solo un'area di interesse. Quindi abilitare l'opzione Traccia macchie nel tempo per calcolare i dati di tracciamento, nonché le statistiche Oggetto-Oggetto per consentire il confronto tra le macchie ed espandere la gamma di dati.
Fare clic sul pulsante Avanti in basso a destra nella finestra della procedura guidata. Specificare una regione di interesse, o area ROI, che racchiude il tectum ottico dell'embrione. Fare clic e trascinare le piccole frecce bianche presenti su ciascuna faccia per modificare la dimensione del ROI.
Quindi estendilo a tutti i fotogrammi registrati con regolazioni dell'intervallo di tempo. Quindi selezionare un canale sorgente e impostare la misura del diametro della cella ottenuta in precedenza come diametro XY stimato. Abilita l'opzione Sottrazione sfondo e fai clic su Avanti.
Immettere i valori di soglia di intensità direttamente nelle caselle di soglia inferiore e superiore per garantire il rilevamento di tutte le celle. Clicca su Visualizza area per osservare tutti questi cambiamenti in tempo reale. Una volta soddisfatto, fare clic su Avanti per convalidare la soglia di qualità selezionata e fare clic su Visualizza area per visualizzare gli spot che soddisfano questi due parametri sovrapposti al canale sorgente.
Quindi, seleziona il Movimento autoaggressivo come algoritmo di tracciamento per tracciare le celle che hanno un movimento più o meno continuo. Osserva il movimento dei punti tra due fotogrammi per giudicare la distanza massima che una cella percorre tra due punti temporali e inserisci un numero stimato nel campo della distanza massima. Per impostare la dimensione massima dello spazio, se l'intervallo tra i fotogrammi è inferiore a 60 secondi, utilizzare una dimensione di tre e, per intervalli di tempo più lunghi, aumentare la stessa.
Abilita il riempimento degli spazi vuoti con tutti gli oggetti rilevati per abbassare la soglia di rilevamento e collegare le tracce. Quindi fare clic su Avanti e lasciare che il software generi automaticamente le tracce per tutti gli spot generati in precedenza. Se le tracce ottenute sono numerose o frammentate, tornare alla Creazione guidata con il pulsante Precedente e regolare la distanza massima precedentemente definita.
Per escludere le tracce di durata compresa tra tre e otto minuti, immettere il valore direttamente nel campo dati per il limite inferiore del filtro della durata della traccia. Fare clic su Avanti per convalidare il filtro e passare alla Creazione guidata. Rimuovere manualmente le tracce generate dai macrofagi cutanei dall'analisi per concentrarsi sulla microglia parenchimale cerebrale.
Utilizzando l'editor delle tracce, è possibile correggere manualmente altri potenziali errori nelle tracce. A destra dell'area di visualizzazione, attivare il pulsante circolare Seleziona modalità ed evidenziare le tracce che richiedono modifiche o regolazioni. Una volta selezionata la traccia problematica, utilizzando i pulsanti Connetti e Disconnetti, modificala per rappresentare correttamente i movimenti della cella.
Con l'editor tracce, selezionare la modalità di selezione del cerchio per eliminare i singoli punti duplicati. Se si utilizza il reporter per microglia con altre cellule parenchimali marcate in fluorescenza, regolare il diametro XY stimato e la distanza massima dalla nuova popolazione cellulare. Modificate l'input del canale sorgente nell'immagine.
Infine, utilizzando la scheda Statistica, estrarre le statistiche di tracciamento desiderate. Fare clic sul pulsante Impostazioni e selezionare le statistiche per il calcolo di ogni oggetto spot o oggetto superficie precedentemente creato. Il cervello del pesce zebra embrionale è stato ripreso nella sua interezza ed è stata visualizzata la posizione dei neuroni rispetto alla microglia.
I dati spaziali ottenuti utilizzando questo protocollo descrivono la velocità media delle cellule microgliali, la distanza media che percorrono in un'ora, il loro spostamento quadratico medio e la loro distribuzione nello spazio in tempi diversi.
