Per iniziare, preparare la soluzione di rivestimento appropriata nel tampone di Tyrode modificato e rivestire un microvetrino a otto pozzetti incubandolo per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi lavare due volte il microvetrino rivestito con il tampone di Tyrode modificato. Incubare il microvetrino in un tampone di Tyrode modificato contenente cinque milligrammi per millilitro di BSA per almeno 30 minuti per estinguere l'adesione aspecifica.
Per preparare le piastrine lavate, centrifugare il sangue intero anticoagulato con citrato a 200 G per 20 minuti per ottenere plasma ricco di piastrine. Quindi aggiungere indometacina e PGE1 al plasma ricco di piastrine e centrifugare a 500 G per 10 minuti. Risospendere il pellet piastrinico risultante nel tampone HEPES di Tyrode modificato a 37 gradi Celsius per ottenere una densità di quattro volte 10 alla potenza di sette piastrine per millilitro.
Lasciare riposare le piastrine isolate per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere la soluzione di DHE alla sospensione piastrinica per ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari e incubare a 37 gradi Celsius per un minuto. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione bloccante dal microvetrino e posizionarla sul tavolino del microscopio per l'imaging.
Quindi erogare delicatamente le piastrine. Utilizzare una lente a immersione in olio 40X su un microscopio confocale invertito per monitorare la conversione del DHE in 2-idrossietidio. Scatta un'immagine per 10 minuti, raccogliendo immagini ogni 10 secondi.
Per monitorare la generazione di anioni superossido in risposta a un agonista, aggiungere un agonista solubile 10 minuti dopo aver dispensato le piastrine e raccogliere immagini a fluorescenza per altri 10 minuti. Utilizzando questo protocollo, è stata studiata la generazione di radicali superossido durante l'adesione piastrinica al collagene o al fibrinogeno e dalle piastrine aderenti al PLL stimolato con trombina.
