Dopo aver raccolto il segantino del pino, coleotteri Monochamus alternatus, metti lo scarabeo in un tubo sterile contenente ramoscelli freschi. Allevare i coleotteri in un'incubatrice non umidificata a 25 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, i coleotteri registrano una diminuzione dell'alimentazione e della mobilità.
Trasferire i coleotteri morti rigidi in camere bagnate. Seziona i coleotteri con infezioni fungine nelle posizioni principali come antenne, testa, torace, addome, ali e zampe. Usando le forbici, taglia i tegumenti di ogni posizione in piccoli pezzi.
Premere delicatamente la superficie esterna di questi pezzi sulla piastra del PDA contenente antibiotici. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 25 gradi Celsius fino a quando i tessuti sono completamente ricoperti di micelio. Quindi trasferire la singola colonia in base alle proprietà fenotipiche su una nuova piastra PDA.
Estrarre il DNA genomico utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico dei funghi. Preparare la miscela PCR con i primer ITS1 e ITS4 per amplificare la regione rDNA-ITS del DNA. Usa una fotocamera per catturare la morfologia di colonie pure di funghi maturi sui lati anteriore e posteriore della piastra PDA.
Prelevare i conidi dalle colonie fungine pure con un ago da inoculazione e trasferirli su un vetrino con una goccia di acqua sterile. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti sul campione senza introdurre bolle. Taglia un blocco di agar da cinque millimetri con un bisturi dal bordo della colonia fungina e trasferiscilo su un vetrino pulito con una goccia di acqua sterile.
Usando un ago sottile, separa accuratamente i funghi dall'agar per osservare strutture specifiche. Al microscopio ottico, osservare la forma asessuata dei funghi, compresa la postura delle ife, dei conidiofori, delle fialidi e dei conidi.
