Per iniziare, sterilizzare la superficie di un coleottero Monochamus alternatus e Tribolium castaneum affamati 24 ore con candeggina, etanolo e acqua distillata. Per indurre l'infezione fungina, per prima cosa, immergere i ramoscelli di pino o la crusca di frumento nella sospensione coniidale per 10 secondi. Quindi immergere i coleotteri nella sospensione conidiale.
Dopo l'essiccazione, mettere uno scarabeo e un ramoscello in un tubo sterile da 50 millilitri. Allevare i coleotteri in un'incubatrice non umidificata a 25 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire i coleotteri morti in una nuova provetta da 50 millilitri e posizionare un pezzo di cotone sterile e umido all'interno della provetta.
Seziona i corpi di coleotteri infetti con infezioni fungine in posizioni come antenne, testa, torace, addome, ali e zampe. Tagliare tappi di dischi da cinque millimetri di colonie fungine mature. Mettere i tessuti di coleottero infetti in glutaraldeide pre-raffreddata al 2,5% a quattro gradi Celsius per due giorni.
Successivamente, lavare i campioni tre volte in tampone fosfato allo 0,1% per cinque minuti e disidratarli in concentrazioni crescenti di etanolo per 10 minuti ciascuno. Asciugare i campioni in un liofilizzatore sottovuoto, quindi osservare le strutture fungine al microscopio elettronico a scansione. Trattare la crusca di frumento con una sospensione conidiale per 10 secondi e, dopo l'essiccazione, trasferirla in una capsula di Petri.
Immergere i coleotteri T.castaneum nella sospensione coniidale per 10 secondi prima di metterli nella capsula di Petri contenente crusca di frumento. Dopo l'incubazione, contare i coleotteri morti dalla piastra. Estrarre il DNA genomico di funghi entomopatogeni parassiti utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico dei funghi.
Utilizzando i set di primer forniti, preparare una miscela di reazione PCR per l'amplificazione gene-specifica. Dopo il sequenziamento, allineare la sequenza nucleotidica utilizzando ClustalX 2. Infine, eseguire l'analisi filogenetica utilizzando MEGA 6 basato sul metodo della massima verosimiglianza.
Funghi parassiti come Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus e Scopulariopsis alboflavescens hanno causato sintomi significativi di infezione in M. alternatus. Le osservazioni SEM hanno ulteriormente supportato le caratteristiche morfologiche di questi funghi parassiti sulla superficie dei coleotteri. L'attività entomopatogena ha mostrato tassi di mortalità significativamente più elevati nei funghi parassiti rispetto al gruppo di controllo.
L'albero filogenetico multi-genico ha dimostrato distanze genetiche tra le tre specie fungine parassite e altre specie all'interno dei rispettivi generi.
