Isolamento elettroporato di cellule cardiache di topo per la selezione e l'analisi cellulare

Per iniziare, ottenere cuori di topo elettrooperati estratti da topi CD1 wild type, da 12 a 12,5 giorni dopo l'incrocio. Trasferisci un cuore in una provetta contenente un millilitro di mezzo di digestione ghiacciato. Con una siringa, applica una leggera pressione sul cuore alcune volte per tritarlo.

Incubare il tessuto tritato su una piastra calda a 37 gradi Celsius per 45 minuti a 600 rotazioni al minuto. Quindi filtrare la miscela di digestione attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una nuova provetta. Quindi, filtrare nuovamente il volume passante con un filtro cellulare da 40 micrometri in una nuova provetta da 50 millilitri.

Pipettare 500 microlitri di FBS nel filtrato. Aumentare il volume fino a 30 millilitri con DMEM freddo. Centrifugare la sospensione a 240G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante. Quindi posizionare il tubo capovolto su un tovagliolo di carta per asciugarlo completamente. Per la selezione cellulare, risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone di selezione.

Infine, aggiungere 0,3 microlitri di DAPI ed eseguire lo smistamento delle cellule. I cuori battevano e sembravano essere in buone condizioni 24 ore dopo l'elettroporazione. Il miocardio e l'epicardio non mostravano alcun segno di apoptosi.

L'analisi dell'attività di fluorescenza ha mostrato un segnale GFP a mosaico in quasi tutte e quattro le camere del cuore.