Dopo aver eseguito l'immunoistochimica sui tessuti FFPE, visualizzare le sezioni utilizzando l'imager digitale di patologia. Avviare il software per eseguire l'unmixing spettrale delle immagini annotate. Seleziona File, quindi fai clic su Apri immagine e scegli i file QPTIFF per caricare le immagini nel software.
Consenti ai timbri contrassegnati come progetti informati di essere caricati nel progetto. Caricare i file QPTIFF predisposti per la compensazione dell'autofluorescenza. Selezionare l'autofluorescenza sullo strumento immagine per tracciare una linea sull'immagine dal vetrino non colorato attraverso strutture autofluorescenti come eritrociti e collagene per compensare l'autofluorescenza.
Quindi vai alla sezione Modifica marcatori e colori. Assegna nomi di marcatori che corrispondano al fluoroforo opale e regola le impostazioni del colore in base all'opzione preferita. Seleziona Prepara tutto nell'angolo in basso a sinistra dell'interfaccia per avviare la demiscelazione dei fluorofori.
Esamina tutte le immagini per verificare la visibilità di tutti i segnali e il completamento con successo del processo di unmixing. Seleziona l'icona del bulbo oculare per spegnere e riaccendere tutti i marcatori uno per uno per verificarne la qualità. Ora vai alla scheda Esporta e crea una nuova directory di esportazione vuota facendo clic sul pulsante Sfoglia situato sotto la directory di esportazione.
Seleziona l'immagine composita e le immagini componenti TIFF multi-immagine nella scheda immagini da esportare. Passa alla scheda Analisi batch che si trova verticalmente a sinistra per l'elaborazione batch delle diapositive e seleziona Crea directory separate per ogni elemento nelle opzioni di esportazione. Per aggiungere diapositive per l'analisi, selezionare i file QPTIFF sotto il pulsante Aggiungi diapositive e caricarli nell'analisi batch.
Selezionare Esegui per avviare l'elaborazione batch delle diapositive. Create una nuova cartella contenente solo i file componenti dall'unmixing spettrale, assicurandovi che la struttura gerarchica delle cartelle rimanga intatta. Avvia l'intero software di visualizzazione delle diapositive.
Fai clic su Crea progetto sul lato sinistro e crea o seleziona una nuova cartella vuota con un nome appropriato. Quindi fai clic su Automatizza e scegli Mostra editor di script. Copia e incolla lo script esistente e modifica la posizione per indirizzarlo verso la cartella che contiene tutti i file dei componenti della diapositiva.
Seleziona Esegui per iniziare il processo di unione in batch delle diapositive, quindi consentilo di completare. Ora sposta i file TIFF OME generati di recente nel progetto QuPath e salvali come nuovo progetto. Quando viene visualizzata una nuova finestra, selezionare Imposta tipo di immagine come fluorescenza, quindi fare clic sul pulsante Importa.
Passare al menu a sinistra, selezionare un campione dall'elenco e fare doppio clic per aprire il campione scelto. Regola l'intensità dei canali facendo clic sull'icona Contrasto per migliorare la visibilità. Seleziona tutti i canali e scegli di ripristinare.
Assicurarsi che l'autofluorescenza sia disattivata. Per disegnare un'area di interesse o ROI per il tumore, fai nuovamente clic sull'icona del contrasto, quindi seleziona Mostra scala di grigi. Successivamente, selezionare il canale del marcatore tumorale e regolare l'intensità per una visibilità ottimale.
Fare clic sullo strumento pennello per disegnare una ROI attorno al tumore. Fai clic su uno strumento e regola il ROI mentre premi il tasto alt per attenuare il ROI dall'esterno. Al termine, unire tutte le parti separate del tumore nella stessa ROI.
Fai clic con il pulsante destro del mouse sull'annotazione ROI nell'elenco a sinistra, seleziona Imposta proprietà e fornisci un nome appropriato. Ad esempio, il tumore. Espandi il ROI per il margine invasivo dalla regione del tumore selezionando Oggetti, quindi Annotazioni, quindi Espandi annotazioni.
Scegliere la dimensione desiderata per il raggio di dilatazione. Selezionare Rimuovi interno e Vincola al padre. Fare clic sull'icona del contrasto, selezionare il canale di autofluorescenza e regolare l'intensità per una visibilità ottimale.
Fai clic sulla bacchetta e regola la ROI mentre premi il tasto alt per attenuare la ROI dall'esterno e rimuovere qualsiasi sfondo che non dovrebbe far parte di questa ROI. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'annotazione nell'elenco a sinistra. Selezionare quindi Imposta proprietà per assegnare un nome appropriato, ad esempio margine invasivo o IM al ROI.
Se lo si desidera, cambiarne il colore. Per esportare le annotazioni, passare all'opzione File, fare clic su Dati oggetto, Esporta come GeoJSON e selezionare Esporta tutti gli oggetti. Continuare con la selezione predefinita durante l'esportazione come raccolta di funzionalità e salvarla nella posizione preferita.
