Frazionamento cellulare delle isole pancreatiche del macaco rhesus per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la metabolomica

Per iniziare, scongelare il tessuto isolato delle isole pancreatiche del macaco rhesus su ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi 0,1X al pellet di tessuto. Utilizzando un pestello a pellet monouso senza RNasi, omogeneizzare delicatamente il tessuto 15 volte sul ghiaccio.

Incubare il campione su ghiaccio per 10 minuti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio all'omogeneizzato e mescolare delicatamente con la pipetta sul ghiaccio. Adescare un filtro di pre-separazione da 30 micrometri con 300 millilitri di tampone di lavaggio e filtrare un millilitro di omogeneizzato cellulare in una provetta da cinque millilitri.

Centrifugare l'omogeneizzato filtrato a 500 g per cinque minuti in una centrifuga a secchiello oscillante a quattro gradi Celsius. Usando una pipetta, trasferisci un millilitro di surnatante in un crioviale su ghiaccio e congelalo immediatamente a meno 80 gradi Celsius per futuri esperimenti di metabolomica. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio goccia a goccia al pellet dei nuclei per risospenderlo.

Centrifugare il pellet lavato a 1.000 g per cinque minuti in una centrifuga a secchio oscillante a quattro gradi Celsius. Dopo aver ripetuto il lavaggio, risospendere i nuclei in un millilitro di tampone di lavaggio. Con una pipetta, mescolare 10 microlitri di sospensione di nuclei e 0,4% di Trypan Blue in una provetta separata e aggiungere la miscela a un vetrino contacellule automatizzato.

Infine, utilizzando un contatore di cellule, determinare la concentrazione dei nuclei. Per gli esperimenti di sequenziamento è stato ottenuto un nucleo integro ideale. Sulla base di studi di espressione genica, è stato ottenuto il raggruppamento UMAP di sottotipi cellulari all'interno di isole fetali isolate, non umane, di primati.

L'abbondanza dei metaboliti delle isole isole, come il diidrossiacetone fosfato, il glicerolo-3-fosfato, il 2-ossoglutarato, la creatina e il glutatione, è stata ottenuta utilizzando le frazioni citosoliche.