Per iniziare, imposta un microscopio a fluorescenza per l'imaging. Inserire un vetrino completamente colorato con sezioni di tessuto immunocolorato. Una volta impostato l'obiettivo, premere il pulsante live e quindi concentrarsi sul campione.
Usare l'icona di scalabilità automatica per valutare se i canali sono adeguatamente saturi di segnale. Dopo aver finalizzato le impostazioni del microscopio, caricare il microscopio con i vetrini di controllo a colori singoli. Concentrati sotto il campione e premi l'opzione di inizio nel menu Z-Stack per avviare la configurazione di uno Z-Stack.
Quindi concentrati sopra il campione e premi l'opzione finale. Per la compensazione della fluorescenza delle immagini, aprire una delle singole immagini di controllo. Osservare le finestre della scala di grigi per ciascun canale per un segnale in un canale inappropriato.
Per rimuovere la smarginatura, inserire manualmente i numeri nella matrice, quindi premere applica per verificare se è stata rimossa adeguatamente. Assemblare quindi tutti i valori di ogni controllo in un'unica matrice. Applicare questa matrice su un campione completamente colorato.
Avvia il software ilastik e apri il file tiff dei fazzoletti. Fare clic sulla scheda di allenamento, quindi utilizzare lo strumento pennello per evidenziare le singole celle sulle immagini. Assicurarsi di evidenziare le celle in modo tale che l'interno e la membrana cellulare siano inclusi.
Quindi, usa l'etichetta due per evidenziare tutto ciò che non è le celle di interesse. Ora avvia il software tre e apri un'immagine IMS del tessuto contenente tutte le macchie fluorescenti. Scegliere l'opzione maschera sui nuclei come canale di origine per il rilevamento dei nuclei.
Quindi seleziona l'opzione avanzata per dividere i nuclei in base ai punti seme. Impostare un valore per il diametro del nucleo. Esaminare l'immagine per verificare la presenza di più celle fuse o di celle mancanti.
Quindi fare clic sull'oggetto celle creato, seguito dalla scheda di creazione, quindi sull'opzione memorizza parametri per batch per salvare le impostazioni di utilizzo. Avvia Anaconda, quindi avvia JupyterLab all'interno di Anaconda. Aprire il file di codifica supplementare 1, quindi premere su Esegui tutte le celle o Esegui celle selezionate nel menu Esegui.
Quando viene visualizzato un messaggio di richiesta, immettere la directory del file per i valori fluorescenti esportati. Quindi inserire la directory dei file per qualsiasi posizione adatta per salvare i file elaborati. Eseguire la sezione successiva del codice per annotare i dati con i nomi di ogni canale.
Una volta stabilita una strategia di gating, fai clic con il pulsante destro del mouse su popolazione nel menu, quindi scegli Esporta. Esporta i parametri come file csv con le intestazioni incluse. Avvia nuovamente JupyterLab in Anaconda.
Quindi apri lo script nel file di codifica supplementare 2 ed esegui il codice. Quando viene richiesto di inserire la posizione del software per il file, inserire la directory dei file csv esportati. Successivamente, quando viene richiesto di aggiungere la posizione di output, scegli una directory di file a scelta e assicurati che la directory dei file includa il nome del file alla fine.
Eseguire il resto del codice. Ora copia il testo in un file txt e apri il file ims corrispondente nel software tre. Fare clic sull'oggetto cella nel file.
Passa alla scheda delle statistiche, quindi incolla il testo nella barra di ricerca e inizia la ricerca. Tutte le celle di interesse verranno ora evidenziate. I coloranti fluorescenti spettralmente sovrapposti sono stati efficacemente separati nel tessuto che è stato colorato con più coloranti.
La separazione dei coloranti ha chiaramente differenziato i diversi tipi di cellule nel tessuto linfatico. L'apprendimento automatico definito dall'utente è stato utilizzato per separare le celle anche quando sono strettamente compattate tra loro.
