Iniettare da uno a tre milligrammi di anticorpo CD45 anti-topo coniugato con fluorofori diluito in 100 millilitri di soluzione fisiologica normale per via endovenosa in ciascun topo anestetizzato. Inizia mettendo quattro millilitri di tampone HEPES ghiacciato preparato in una provetta specializzata per dissociatori tissutali sul ghiaccio per ogni topo. Dopo l'eutanasia del topo, posizionare i polmoni resecati nel rispettivo tubo dissociatore tissutale, raffreddato su ghiaccio.
Posizionare le provette sul dissociatore tissutale automatizzato ed eseguire il primo programma preimpostato per il tessuto polmonare. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione madre di liberase e 500 microlitri di soluzione madre di aminoguanidina a ciascuna provetta contenente il tessuto polmonare dissociato. Incubarlo su un mixer nutante per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Successivamente, riposizionare i tubi sul dissociatore ed eseguire il secondo programma preimpostato per il tessuto polmonare. Ora versare la sospensione unicellulare dal tubo dissociatore tissutale attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare la provetta del dissociatore tissutale con cinque millilitri di EHAA completo e passare attraverso il colino nella provetta da 50 millilitri.
Dopo aver rimosso il filtro, aumentare il volume della sospensione cellulare a 50 millilitri con EHAA completo. Invece di utilizzare tubi dissociatori tissutali specializzati, posizionare i polmoni resecati nelle rispettive provette da 1,5 millilitri-microfuge raffreddate su ghiaccio. Una volta che tutti i polmoni sono stati prelevati, trasferire ciascun polmone in una nuova provetta per microfugi senza alcun mezzo cellulare.
Usando le forbici, taglia i polmoni in piccoli frammenti all'interno del tubo di microfuga. Aggiungere un millilitro di cocktail digestivo liberase TM e DNase I in ogni tubo. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius a bagnomaria.
Quindi, versare il campione su un colino cellulare da 100 micrometri posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Pipettare il campione rimanente sul colino. Schiacciare il tessuto contro la rete con l'estremità in gomma dello stantuffo da una siringa sterile da un millilitro.
Sciacquare il colino con un tampone selezionatore a freddo, raccogliendo un volume finale di sette millilitri nel tubo. Sia che si utilizzi il metodo di dissociazione automatizzato o manuale, centrifugare la sospensione cellulare ottenuta. Aspirare con cura il surnatante, lasciando circa 100 microlitri di surnatante e il pellet cellulare.
Infine, aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di blocco Fc per portare il volume totale fino a 200 microlitri e agitare energicamente per risospendere il pellet.
