Per iniziare, acquisisci le immagini confocali di fette di ippocampo di topo. Dopo aver aperto il file immagine nel software Neurolucida 360, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento di spostamento/punto di rotazione situato nella barra degli strumenti superiore della finestra dell'ambiente 3D. Quindi, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite desiderato per stabilire il nuovo punto di rotazione.
Successivamente, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sull'icona di ripristino dell'orientamento per ripristinare la vista originale. Quindi, fai nuovamente clic sullo strumento Sposta/Punto di rotazione per continuare a tracciare il dendrite. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda dell'albero all'interno della finestra dell'ambiente 3D.
Selezionare "Guidato dall'utente" per la modalità di tracciamento e i kernel direzionali, come metodo in Opzioni di tracciamento guidate dall'utente. Per avviare il tracciamento dei dendriti, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite non appena viene visualizzato un kernel circolare. Quindi, sposta il cursore lungo il segmento dendritico.
Per garantire una popolazione continua del kernel, spostare delicatamente il cursore avanti e indietro sul dendrite. Quindi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse per proteggere tutti i kernel che sono stati rilevati. Se i chicchi si impadroniscono del popolamento, fare clic con il pulsante sinistro del mouse nel punto in cui appare un kernel più avanti lungo il dendrite per posizionarlo manualmente e fare clic con il pulsante destro del mouse per interrompere il tracciamento.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare all'interno della finestra dell'ambiente 3D per verificare la precisione del tracciamento dendritico in tutte e tre le dimensioni, beccheggio, imbardata e rollio. Individua tutti i punti in cui il tracciato dei dendriti si discosta dal percorso previsto. Per correggere eventuali imprecisioni nel tracciato dei dendriti, accedere alla scheda di modifica situata nel menu ad albero.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite di interesse, quindi fare clic sui punti per apportare le modifiche necessarie. Quindi, sposta i punti posizionati in modo errato sul segmento dendrite, facendo clic e trascinando. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto estraneo per rimuoverlo, quindi fare clic sul pulsante Elimina.
Se i punti non coprono adeguatamente il segmento di dendrite, regolarne le dimensioni facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su di essi e modificando lo spessore utilizzando il cursore. Successivamente, vai alla scheda del dorso all'interno della finestra dell'ambiente 3D. Impostare le impostazioni di rilevamento per la portata esterna, l'altezza minima e il numero minimo di voxel.
Regolare la sensibilità del rivelatore al 70%, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Rileva tutto" per identificare le spine su tutti i dendriti in base al livello di sensibilità impostato. Per una selezione specifica del dendrite, prendi l'opzione Fare clic sull'immagine"per rilevare tutto sul ramo più vicino e fare clic manualmente con il pulsante sinistro del mouse su ciascun dendrite per applicare diverse sensibilità del rivelatore. Dopo aver rilevato le spine, fare clic e trascinare il dendrite in tutte e tre le direzioni per esaminare la copertura.
Se le spine rilevate sono poco riempite, aumentare la sensibilità del rivelatore dal 5% al 10% e fare clic su Rileva tutto" per sostituirle a un livello di sensibilità più alto. Se vengono rilevate spine troppo piene, ridurre la sensibilità del rivelatore dal 5% al 10% e selezionare Rileva tutto" ancora una volta per aggiornare il rilevamento della colonna vertebrale con una sensibilità inferiore. Quindi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse su Mantieni dorsi esistenti"nella scheda del dorso dell'ambiente 3D.
Se l'opzione "Fai clic sull'immagine per rilevare tutto sul ramo più vicino" è attiva, assicurati di deselezionarla. Per concentrarsi su un dendrite specifico per un'ulteriore analisi della colonna vertebrale, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Sposta punto di rotazione"e quindi fare clic sul dendrite desiderato per impostare il punto di rotazione. Una volta impostato il punto di rotazione, deseleziona Sposta punto di rotazione"Identifica una spina dendritica che appare vuota.
Aumentare la sensibilità del rivelatore dal 10% al 20% oltre l'impostazione precedente e fare clic con il pulsante sinistro del mouse direttamente sul dorso. Se la colonna vertebrale non viene popolata, verrà visualizzato il messaggio Impossibile rilevare una spina dorsale nella posizione selezionata". Aumentare la sensibilità del rivelatore in modo incrementale, potenzialmente superiore al 100%, fino a quando non viene rilevata una spina dorsale e riempita adeguatamente.
Per correggere un dorso non riempito, vai alla scheda di modifica e fai clic con il pulsante sinistro del mouse su di esso. Scegli Rimuovi"quindi deseleziona la scheda di modifica. Aumenta la sensibilità dal 5% al 10% e fai nuovamente clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso.
Per un dorso troppo pieno, vai alla scheda di modifica e selezionala. Fare clic su Rimuovi"quindi deseleziona la scheda di modifica. Riduci la sensibilità dal 5% al 10% e fai clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso.
Ispezionare il dendrite per eventuali spine che potrebbero appartenere a dendriti vicini, falsi positivi o segmenti dendritici erroneamente identificati come spine. Utilizza Rimuovi"per eliminare queste imprecisioni. Quindi, accedi alle spine identificate sul dendrite.
Nei casi in cui più spine potrebbero apparire fuse in un unico conglomerato, accedi alla scheda di modifica, seleziona la spina dorsale del conglomerato e fai clic su Nascondi selezione"per valutare. Se confermato, all'interno della scheda di modifica, scegli Mostra selezione"e poi dividi per separare i dorso. Con tutte le spine identificate visivamente e rappresentate correttamente, passa alla scheda della colonna vertebrale e seleziona Classifica tutto" per classificarle in sottili, a fungo, tozze e filopodi.
Dopo aver completato tutti i rilevamenti e le classificazioni della colonna vertebrale, nella barra degli strumenti superiore della finestra dell'ambiente 3D, selezionare Salva e visualizza in Neurolucida Explorer per salvare i dati raccolti dai tracciati. All'interno della finestra Esplora, vai alla scheda di visualizzazione e fai clic con il pulsante sinistro del mouse su Seleziona tutto"per evidenziare tutti i dendriti e le spine. Quindi, procedi alla scheda di analisi situata nella barra degli strumenti superiore.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul menu a discesa della struttura e selezionare Analisi della struttura dei rami"per avviare un'analisi strutturale dettagliata degli elementi evidenziati. Per l'analisi della densità e del volume medio della spina, selezionare ogni albero e ogni dendrite. Quindi, fai clic su Spine"seguito da Dettagli spine"Fai clic su OK"per eseguire l'analisi e i risultati verranno visualizzati in due finestre distinte.
