Per isolare le cellule staminali neuro o NSC dalle zone subventricolari dei neuroni sezionati o SVZ, tagliare ogni SVZ in quattro o cinque piccoli pezzi per facilitare la disgregazione del tessuto. Utilizzando una pipetta da pasteur sterile in plastica, trasferire le SVZ tritate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri, assicurandosi che non rimangano frammenti nella piastra. Lasciare che il tessuto si sedimenti sul fondo della provetta prima di rimuovere il DPBS rimanente.
Aggiungere 500 microlitri di miscela enzimatica filtrata per le due SVZ per cervello e incubare la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di terreno di controllo preavvertito a 37 gradi Celsius a ciascun campione. Centrifugare il campione a 300 G per cinque minuti.
Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta o una pompa a vuoto. Utilizzando una pipetta di vetro da pascolo lucidata a fuoco, aggiungere un millilitro di mezzo di controllo al pellet. Disaggregare meccanicamente il pellet con cura pipettandolo su e giù da 10 a 20 volte fino ad ottenere una sospensione cellulare omogenea.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno di controllo e mescolare per inversione per lavare le cellule. Dopo aver centrifugato a 300 G per cinque minuti, risospendere in modo omogeneo il pellet risultante in un millilitro di terreno completo pipettando su e giù 10 volte. Dopo aver diluito una parte di un'aliquota della sospensione cellulare con una parte di blu di tripano, contare le cellule utilizzando una camera neubauer al microscopio.
Garantire la disaggregazione cellulare a livello di singola cellula prima di seminare le cellule in modo uniforme in otto pozzetti di una piastra a 48 pozzetti in un volume finale di 500 microlitri di terreno completo. Incubare le cellule per cinque-sette giorni per consentire la formazione delle neurosfere primarie.
