Per iniziare, aggiungi 1,5 millilitri di etanolo al 70% a 30 milligrammi di particelle di tungsteno da 0,7 micrometri in un microtubo. Centrifugare la miscela a 13,200 g per 15 minuti. Aggiungere 1,5 millilitri di acqua sterile alle particelle, quindi agitare e centrifugare di nuovo.
Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di glicerolo sterile al 50% alle particelle di tungsteno. Per rivestire le particelle, aggiungere prima cinque microgrammi di un plasmide da due micron e 15 microgrammi di un plasmide batterico contenente la sequenza mitocondriale in un microtubo posto sul ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di particelle di tungsteno al tubo e al vortice.
Quindi aggiungere quattro microlitri di spermidina monomolare e vorticare di nuovo. Ora pipettare 100 microlitri di cloruro di calcio 2,5 molari ghiacciato nella provetta. Dopo aver fatto girare brevemente la sospensione, incubarla con ghiaccio per 10 minuti.
Centrifugare le particelle di tungsteno a 13, 200 G per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare le particelle in 200 microlitri di etanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Infine, risospendere le particelle di tungsteno in 60-70 microlitri di etanolo al 100% a temperatura ambiente.
Per preparare i materiali biolistici, posizionare sei supporti per macrocarrier sterilizzati su una lastra di vetro sterile. Utilizzare un paio di pinze sterili per inserire i macrocarrier in ciascuno dei sei macrocarrier holder. Pipettare 10 microlitri di particelle di tungsteno codificate con DNA su ciascuna superficie del macrocarrier e distribuirle uniformemente su tutta la superficie con il puntale della pipetta.
Inoculare il ceppo del recettore del lievito rho zero in due millilitri di terreno YPR. Coltiva la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius in una ruota rotante. Il giorno successivo, trasferire 300 microlitri di coltura in una provetta contenente 30 millilitri di terreno YPR fresco.
Posizionare la coltura su uno shaker rotante per due notti a 30 gradi Celsius e 200 giri al minuto fino a quando la coltura non è satura. Centrifugare le cellule di lievito a 600 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 600 microlitri di terreno YPD dopo aver scartato il surnatante.
Ora usa un manico di vetro sterile per distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare di lievito su una piastra di terreno di bombardamento solido. Dopo aver distribuito tutte le colture, incubare le piastre a temperatura ambiente per una o tre ore prima del bombardamento.
