Per iniziare, ottenere la coltura cellulare PANC-1 e lavare le cellule con nove millilitri della soluzione salina bilanciata di Hank con incrementi di tre millilitri. Incubare le cellule con due millilitri di tripsina per circa 10 minuti. Per neutralizzare la sospensione, aggiungere tre millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS.
Dopo aver lavato le celle sette volte con incrementi di un millilitro, raccogliere ciascuna aliquota neutralizzata in una provetta da 15 millilitri. Allo stesso modo, ottenere cellule stellate pancreatiche umane tripsinizzate, o HPaSteC, utilizzando la soluzione di neutralizzazione della tripsina e i terreni cellulari stellati. Miscelare la quantità necessaria di entrambe le sospensioni cellulari in 11 millilitri di DMEM con il 10% di FBS evitando la formazione di schiuma.
Erogare delicatamente 100 microlitri di miscela di sospensione cellulare nella piastra di coltura e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il terzo giorno, aggiungere 50 microlitri di DMEM con il 10% di FBS a ciascun pozzetto lungo il lato del pozzetto. Il giorno 10 o 11, aspirare il terreno esaurito senza disturbare la soluzione vicino all'alone e aggiungere 100 microlitri di terreno fresco lungo il lato di ciascun pozzetto.
Il giorno 14 o 17, utilizzando una pipetta da un millilitro, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto fino a raggiungere l'alone. Allineare la piastra contro lo sfondo della cappa per individuare gli sferoidi nella parte inferiore. Pipettare delicatamente circa 50 microlitri di terreno vicino agli sferoidi per disturbarli per il ristagno.
Si è scoperto che gli sferoidi ottenuti il giorno 14 crescono fino a un volume medio di 0,048 millimetri cubi.
