Per iniziare, posiziona il topo soppresso in posizione supina sulla panca pulita. Taglia lungo la linea mediana dell'addome del topo e separa le strutture addominali strato per strato. Usando una pinzetta, apri delicatamente il grande omento e lo stomaco.
Quindi estrarre delicatamente la milza con il legamento gastrosplenico e separarla senza mezzi termini dai tessuti e dai legamenti circostanti per ottenere una milza intatta. Posizionare un filtro cellulare da 70 micron in una piastra di coltura sterile da 100 millimetri. Aggiungere la milza al colino cellulare e schiacciarla con uno stantuffo della siringa.
Aggiungere da cinque a otto millilitri di liquido di lavaggio omogeneizzato per spingere le cellule spleniche attraverso il filtro nella piastra di coltura. Centrifugare il filtrato a 450 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet con il diluente campione fornito con il kit di separazione dei linfociti.
Dopo aver contato le cellule su un emocitometro, regolare la concentrazione cellulare a 2 X 10 alla potenza di otto cellule per millilitro. In una provetta da centrifuga, prelevare la stessa quantità di soluzione di separazione dei linfociti della sospensione di una singola cellula tissutale. Pipettare con cura la sospensione monocellulare sulla superficie della soluzione di separazione dei linfociti e centrifugare a 800 g per 30 minuti a 25 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, osservare i quattro strati nella provetta dall'alto verso il basso. Utilizzando una pipetta, aspirare con cautela lo strato anulare di linfociti bianchi lattiginosi in un'altra provetta. Aggiungere 10 millilitri di soluzione detergente al tubo per mescolare le cellule.
Centrifugare la sospensione cellulare a 250 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno RPMI 1640 per il conteggio delle cellule.
