Purificazione e analisi di cellule T CD4⁺ naive di topo mediante selezione negativa basata su biglie magnetiche

Per iniziare, preparare una sospensione di una singola cellula splenica di topo con una volta 10 alla potenza di otto cellule per millilitro in un volume da 0,1 a due millilitri. Aggiungere 50 microlitri di siero di ratto al campione. Trasferire il campione in una provetta a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri.

Aggiungere 50 microlitri di cocktail di isolamento al campione. Mescolare bene e incubare per 7,5 minuti a temperatura ambiente. Ora aggiungi 50 microlitri per millilitro di cocktail di esaurimento.

Mescolare bene e incubare per 2,5 minuti. Nel frattempo, agitare le perline magnetiche per garantire una dispersione uniforme. Aggiungere 75 microlitri di perline magnetiche al campione.

Mescolare bene e incubare per 2,5 minuti. Rabboccare il campione con RPMI 1640 medium fino a un volume finale di 2,5 millilitri e mescolare più volte. Quindi posizionare il tubo nel magnete per 2,5 minuti.

Prendi il magnete e capovolgilo con il tubo con un movimento continuo, versando la sospensione cellulare arricchita in un nuovo tubo. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Eseguire l'analisi citofluorimetrica per le cellule T positive CD quattro naive prima e dopo l'isolamento.

Dopo il gating, trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga. Centrifugare a 400 g per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 200-500 microlitri di terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS.

Per ogni millilitro di coltura cellulare, aggiungere due microlitri di cocktail di attivazione leucocitaria e mescolare. Coltiva le cellule in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius con umidità satura per quattro-sei ore.