Per iniziare, posiziona un occhio di topo formale e fisso su un pezzo di carta oleata sotto un microscopio da dissezione. Con un paio di micro pinze, tieni i resti del muscolo e del nervo ottico. Quindi orientare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta da un lato.
Ora usa una lama chirurgica per praticare un'incisione lunga uno o due millimetri dietro e parallela al limbus. Applicare una forza verso il basso con la lama tenendo l'occhio in posizione fino a quando il segmento anteriore non si separa dall'estremità posteriore. Quindi scartare il segmento anteriore e la lente.
Trasferisci il segmento posteriore in un piatto di sei centimetri riempito di PBS. Usa una micro spatola per estrarre la retina mentre contemporaneamente tieni il nervo ottico con una micro pinza. Per sciacquare la retina, trasferirla in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti che ha sei pozzetti riempiti con acqua distillata doppia.
Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare con cura l'acqua su e giù adiacente alla retina mentre si soffia l'acqua per provocare una leggera agitazione. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro rovesciata per trasferire la retina nel secondo pozzetto. Per digerire la retina, trasferire la retina sciacquata in una soluzione di tripsina in una piastra a 12 pozzetti con una pipetta di vetro rovesciata.
Centrare un puntale per pipetta P200 imbevuto di tripsina sul nervo ottico. Quindi pipettare delicatamente l'intera rete vascolare su e giù per dissociare il tessuto non vascolare. Ora, utilizzare una pipetta di vetro rovesciata pre risciacquata in tripsina per trasferire il sistema vascolare retinico in un pozzetto contenente acqua distillata doppia in una piastra a sei pozzetti.
Agitare la piastra, quindi pipettare il sistema vascolare su e giù con una pipetta di vetro sciacquata con tripsina invertita per rimuovere qualsiasi residuo di tessuto non vascolare. Trasferire con cautela il sistema vascolare retinico al centro della regione contrassegnata su un vetrino per microscopia a superficie carica. Quindi utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con cura l'acqua in eccesso da un bordo.
Posizionare il vetrino in una cabina di biosicurezza vicino al lato anteriore per far evaporare l'acqua residua. Quando il sistema vascolare è quasi asciutto, trasferirlo al microscopio a contrasto di fase. Utilizzare una pipetta P200 per aggiungere lentamente acqua distillata doppia su un lato della regione contrassegnata per reidratare accuratamente il sistema vascolare.
La fissazione del sistema vascolare retinico isolato ha portato a un tessuto strutturalmente robusto e sufficientemente durevole adatto per le misurazioni AFM. Al contrario, i vasi retinici isolati dagli occhi non fissi o fissati brevemente si sono frammentati e collassati.
