Per iniziare, sciacquare i vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina reticolata con glutaraldeide in PBS contenente calcio magnesio circa cinque volte su uno shaker orbitale. Durante i primi tre risciacqui, sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando una pinzetta sterile per consentire un risciacquo accurato della glutaraldeide. Successivamente, sostituire il terreno di coltura dei REC di topo con terreno fresco integrato con acido ascorbico sterile e filtrato.
Dopo 15 giorni di trattamento, sciacquare le cellule con PBS senza calcio e magnesio. Incubare le cellule in 250 microlitri di tampone di decellularizzazione caldo per due o tre minuti. Confermare la decellularizzazione delle cellule al microscopio a contrasto di fase.
Pipettare delicatamente il tampone senza disturbare la matrice subendoteliale secreta da REC. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di PBS in ogni pozzetto. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere 200 microlitri di DNasi senza RNasi.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti per rimuovere tutti i detriti cellulari. Successivamente, visualizzare la matrice sottoendoteliale fibrosa su macroscala al microscopio a contrasto di fase. Quindi utilizzare un microscopio confocale per visualizzare le fibre di matrice nanometriche più fini con un ingrandimento di 100x.
Aggregati di matrice subendoteliale sono stati osservati sui vetrini coprioggetti dopo la decellularizzazione di colture di 10 o 15 giorni di REC umani o murini. La microscopia confocale delle matrici decellularizzate ha mostrato una densa matrice nano fibrillare di collagene-IV e fibronectina.
