Per iniziare, ottenere una fetta di tessuto polmonare di topo inclusa in paraffina e metterla in un forno a 65 gradi Celsius per 60 minuti. Per la colorazione, immergere il vetrino con la sezione di tessuto in sequenza nei barattoli di colorazione contenenti le soluzioni appropriate. Diluire la soluzione modificata per il recupero dell'antigene del citrato di sodio 50 volte con acqua deionizzata.
Dopo aver preriscaldato l'estratto di antigene nel microonde ad alta potenza, posizionare il vetrino per 15 minuti a bollire. Dopo che il vetrino si è raffreddato a temperatura ambiente, lavarlo due volte con PBS per cinque minuti ciascuno. Quindi permeabilizzare il tessuto con tritone allo 0,25% due volte per 10 minuti ciascuna.
Circondare il tessuto con una penna immunoistochimica e incubare il vetrino con il 5% di BSA a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, diluire l'isolectina B4, o IB4, con l'1% di BSA in un rapporto di 1 a 50. Dopo aver rimosso l'acqua in eccesso, incubare la sezione di tessuto con 50-100 microlitri di IB4 diluito per una notte a quattro gradi Celsius.
Lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno e permeabilizzare con tritone allo 0,25% per 10 minuti. Quindi incubare la sezione di tessuto con 50-100 microlitri di DAPI a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo tre lavaggi PBS, applicare una goccia di mezzo di montaggio anti-sbiadimento sulla diapositiva, evitando l'esposizione alla luce.
Monta il vetrino essiccato all'aria sotto un microscopio a fluorescenza per acquisire immagini del nucleo e dei segnali target. Questo protocollo consente la localizzazione e l'osservazione precise della microvascolarizzazione polmonare utilizzando IB4 per la colorazione di cellule microendoteliali in diversi lobi polmonari di topo al microscopio a fluorescenza.
